紅松松仁蛋白肽的分離純化及體外抗氧化和體內抗疲勞作用

鄭元元，井 晶，王振宇*，彭方帥

（哈爾濱工業大學化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

隨著現代社會的快速發展和生活節奏的加快，人們的工作、學習壓力越來越大，疲勞造成的身體不適和工作效率減退困擾著人們。最早由日本學者提出的“猝老死”是由于長期工作導致壓力太大而引起的癥狀。通常情況下疲勞是短暫的，但少部分人具有持續的、令人虛弱的疲勞癥狀，其被稱為“慢性疲勞綜合征”，嚴重影響人們的身體健康和心理健康[1]。此外，研究發現氧化應激也會引起疲勞，氧化損傷會產生大量的自由基，促進疲勞的產生。根據Harman[2]的“自由基學說”，短暫的劇烈運動、長時間的壓力以及長期勞累過度而得不到有效的緩解都會破壞機體的抗氧化活性和氧化系統的平衡，導致自由基大量堆積，從而限制運動的持續進行[3]。疲勞是一種復雜的癥狀[4]，而氧化應激在疲勞的產生過程中扮演著重要角色，因此保護機體不受氧化傷害是預防疲勞的有效方法[5-6]。隨著對抗疲勞研究的逐步深入，許多有效的抗疲勞產品被發現，包括動植物蛋白[7]、動植物蛋白肽[8-10]和乳源性蛋白肽[11-12]等。現代營養學研究表明，蛋白質通過消化道酶作用后不是全部以游離氨基酸的形式被吸收，而是部分以短肽的形式直接被身體吸收。因此，將大分子蛋白分解成小分子肽是近年來研究的重點。目前，制備肽的主要方法是酶解法，肽的分離純化方法主要有超濾法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、制備型高效液相色譜法等。

紅松（Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.）主要產于我國東北長白山到小興安嶺一帶，松仁是紅松屬植物種子成熟去皮后得到的果仁，含有豐富的蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質、維生素等，具有較高的營養價值[13]。目前，松仁的開發只局限于壓榨松仁油，對其副產物松仁蛋白的開發較少，因此有必要對松仁蛋白進行深入探究。近年來，關于松仁蛋白活性肽的研究主要集中在其抗氧化活性、抗腫瘤活性、血管緊張素轉化酶抑制活性等方面，但對松仁蛋白肽的抗疲勞功能還鮮有研究；因此對松仁蛋白進行深度開發具有重要的意義。

本研究是以紅松松仁蛋白粉為原料，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解，再經超濾、離子交換樹脂及凝膠過濾制備出松仁蛋白肽，并對其體外抗氧化活性和體內抗疲勞功能進行鑒定，為紅松松仁資源的深度開發和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明種清潔級雄性小鼠（18～22 g）購于哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心，許可證號：SCXK（黑）2002-0002。

西洋參（規格XYSDP）購自吉林省康象參茸有限公司，由黑龍江中醫藥大學教研室鑒定為西洋參；紅松松仁購于黑龍江小興安嶺地區農戶家中。

SP Sephadex C-25陽離子交換柱、Sephadex G-25陽離子交換柱、胃蛋白酶 美國Sigma公司；胰蛋白酶 無錫雪梅酶制劑有限公司；活性炭 天津市天大化學試劑廠；肝糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒、全血乳酸試劑盒、丙二醛試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

血糖儀 南京建成生物工程研究所；PB-10 pH計德國塞多利斯公司；LD5-2A離心機 北京醫用離心機廠；FD-1真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；UV-2100紫外分光光度計 上海尤尼柯有限公司；85-2數顯恒溫磁力攪拌器 溫州市醫療電器廠；1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 松仁蛋白的提取

松仁蛋白采用超聲輔助水提法制備[14]。將紅松松仁去殼及紅衣，粉碎，過40 目篩后與石油醚以料液比1∶10混合脫脂，重復3 次，即得脫脂松仁粉。將脫脂松仁粉與蒸餾水以料液比1∶25混合，在500 W的超聲功率下50 ℃超聲100 min，4 000 r/min離心15 min取上清液，用1 mol/L HCl溶液調節pH值至4.6以沉淀蛋白，4 000 r/min離心20 min取沉淀，用蒸餾水充分沖洗，加1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0，樣品于－20 ℃預凍24 h后冷凍干燥，研磨后即得松仁蛋白。

1.3.2 松仁蛋白粗酶解物的制備

采用胃蛋白酶進行第1步水解，水解條件為：pH 2.5，水解溫度37 ℃，加酶量5 000 U/g，水解時間2 h；采用胰蛋白酶進行第2步水解，水解條件為：pH 8.00，水解溫度45 ℃，加酶量10 000 U/g，水解時間90 min。在此條件下制備的松仁蛋白粗酶解產物進行后續實驗。

1.3.3 超濾

分別采用截留分子質量為3 kDa和10 kDa的超濾離心管進行分離，得到小于3 kDa、3～10 kDa、大于10 kDa的3 種分子質量的水解產物，分別收集、凍干保存并測定其抗氧化活性。

1.3.4 SP Sephadex C-25陽離子交換層析

將超濾得到的抗氧化活性最強的組分配制成20 mg/mL溶液，過0.22 μm水系濾膜，采用SP Sephadex C-25陽離子交換柱（1.6 cm×60 cm）進行分離，上樣量1.5 mL，首先用pH 4.0的醋酸鈉緩沖液平衡柱子，之后用不同濃度NaCl-醋酸鈉緩沖液進行線性洗脫，流速為0.5 mL/min，于220 nm波長處測定吸光度并收集組分，將分離出的組分分別冷凍干燥，測定各個組分的抗氧化活性。

1.3.5 Sephadex G-25凝膠層析

將1.3.4節中抗氧化活性最強的組分配制成20 mg/mL溶液，過0.22 μm水系濾膜，采用Sephadex G-25凝膠層析柱（1.6 cm×60 cm）進行分離，上樣量1.5 mL，以去離子水為洗脫液，流速為0.5 mL/min，于220 nm波長處測定吸光度并收集組分，將分離出的組分分別凍干，測定各個組分的抗氧化活性。

1.3.6 松仁蛋白多肽分子質量分布的測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）測定松仁蛋白多肽的分子質量范圍，選用不同分子質量（98 400、65 000、23 700、10 250、6 100、1 100 Da）的聚乙二醇為標準品。色譜條件：流動相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液和0.05 mol/L NaCl溶液（pH 7.0），流速為0.5 mL/min，色譜柱為SRT SEC-300，進樣量為100 μL，檢測溫度25 ℃，柱溫25 ℃。

1.3.7 體外抗氧化活性的測定

羥自由基清除能力的測定參考Amarowicz等[15]的方法。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定參考Wang Bin等[16]的方法。

1.3.8 體內抗疲勞實驗模型的建立

參考Zhao Yuqin[4]和Guo Hang[17]等的方法，將小鼠隨機分為5 組，每組10 只，空白組小鼠給予生理鹽水灌胃。西洋參是公認的抗疲勞物質，具有良好的抗疲勞作用[18-19]，因此陽性組小鼠灌胃0.1 mg/g西洋參。其他3 組小鼠分別灌胃0.05、0.10 mg/g和0.20 mg/g松仁蛋白多肽（PDII組分），相應記為低、中、高劑量組。連續灌胃受試小鼠4 周，測定各指標水平。

1.3.9 測定指標

1.3.9.1 強迫游泳實驗

小鼠在最后一次灌胃后休息30 min，每組5 只小鼠尾部負5%體質量的鉛塊，放入游泳池（水溫（25±1）℃，水深不低于30 cm）。不斷攪拌水以確保小鼠的持續運動，直到小鼠沉沒超過10 s，不再浮出，認為其體力消耗盡而死亡。從游泳開始到小鼠死亡的時間記錄為游泳力竭時間/min。

1.3.9.2 生理生化指標的測定

在最后一次灌胃后，小鼠休息30 min，各組其余5 只動物放入游泳池（水溫（25±1）℃，水深不低于30 cm）。不斷攪動水以確保小鼠的持續運動。游泳30 min后，將小鼠從池中取出并用紙巾擦干。從眼球取血樣后，立即取出小鼠肝臟、脾臟和胸腺，用生理鹽水反復漂洗，去除血液，剔除脂肪及結締組織，濾紙吸去多余水分，稱質量，其與體質量的比值即為臟器指數。將全血以3 500×g離心15 min以獲得血清，并將收集的樣品貯存在－80 ℃，保存期不超過1 個月。根據試劑盒說明書測定血乳酸、血清尿素氮、丙二醛濃度和肝糖原含量，使用血糖測定儀測定血糖濃度。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 超濾各組分抗氧化活性分析

圖1 超濾各組分的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of ultraf i ltration fractions

松仁蛋白粗酶解物經超濾分離得到3 個組分，分別記為P1（分子質量小于3 kDa）、P2（分子質量3～10 kDa）、P3（分子質量大于10 kDa）。由圖1可知，P1組分的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）低于其他組分，且極顯著低于粗酶解物（P＜0.01），抗氧化活性最強，因此，選擇P1組分進行下一步純化。

2.2 SP Sephadex C-25分離結果

圖2 P1組分的SP Sephadex C-25分離洗脫曲線Fig.2 Elution curve of fraction P1 on SP Sephadex C-25 column

由圖2可知，P1組分經SP Sephadex C-25陽離子樹脂分離后得到4 個組分，分別記為PA、PB、PC、PD。

圖3 各洗脫組分的羥自由基和DPPH自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl and DPPH radical scavenging capacity of the eluted fractions

由圖3可知，PD組分羥自由基和DPPH自由基的IC50低于其他組分，即清除能力均高于其他組分，即當NaCl濃度為0.10 mol/L時，洗脫組分的抗氧化活性最強。因此，選擇PD組分進行下一步純化。

2.3 Sephadex G-25分離結果

圖1 PD組分的Sephadex G-25分離洗脫曲線Fig.1 Elution curve of PD on Sephadex G-25 column

由圖4可知，PD組分經Sephadex G-25分離后得到3 個組分，分別記為PDI、PDII、PDIII。

圖5 各洗脫組分的羥自由基和DPPH自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl and DPPH radical scavenging capacity of the eluted fractions

如圖5所示，PDII組分的羥自由基和DPPH自由基IC50低于其他組分，即清除能力最強，與粗酶解物相比具有極顯著差異（P＜0.01），因此，選擇PDII組分進行后續研究。

2.4 松仁蛋白多肽分子質量分布分析

圖6 松仁蛋白肽PDII的凝膠色譜Fig.6 Gel fi ltration chromatogram of PDII

利用GPC進行分子質量分布曲線的繪制，標準分子質量（mp/Da）對數與保留體積（Vp/mL）的線性關系為：lg mp＝12.980 0－2.673 5Vp＋0.294 4Vp2－0.012 0Vp3，r2＝0.999 548。如圖6所示，數均分子質量（mn）為693 Da，重均分子質量（mw）為878 Da，分子質量分布范圍主要為500～1 100 Da。

2.5 體內抗疲勞能力測定結果

表1 各實驗組小鼠的負重游泳時間Table1 Weight-loaded swimming time of mice from all groups

運動耐力是反映身體疲勞程度最直接和客觀的指標。游泳疲勞模型是評估抗疲勞能力的運動實驗模型，可以評估小鼠的耐力，具有很高的重現性[20-21]。運動耐力的提高是抗疲勞作用最有力的體現。在實驗中，通過負重游泳實驗研究了PDII的抗疲勞作用，游泳時間的長短反映疲勞程度。由表1可知，與空白組相比，松仁蛋白肽低、中、高劑量組和陽性組游泳時間均有所延長，低劑量組與空白組相比具有顯著差異（P＜0.05），中、高劑量組以及陽性組與空白組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。高劑量組比陽性組小鼠游泳時間延長率增加了17.02%，表明PDII能起到延長小鼠的運動時間、提高其運動耐力的作用。

表2 各實驗組小鼠的臟器指數Table2 Organ indices of mice from all groups

小鼠體質量和各個器官的臟器指數增加或減少過快，都不利于小鼠的生長。肝臟、脾臟和胸腺分別是人體最重要的代謝和解毒器官、最大的淋巴器官和重要的免疫器官。由表2可知，小鼠在劇烈運動后，松仁蛋白肽高劑量組的肝臟指數、脾臟指數及胸腺指數與空白組相比都有所增加，但無顯著性差異，說明松仁蛋白肽在一定程度上可以緩解小鼠的疲勞癥狀。

血糖是中樞神經系統能量供應的主要來源之一，也是紅細胞能量供應的唯一來源。因此，維持血糖平衡對器官功能至關重要[22]。長時間的力竭運動導致大量碳水化合物的消耗，血糖濃度的下降直接影響到腦細胞的能量供應，導致大腦的活動減少和身體疲勞。肝糖原是由許多葡萄糖分子聚合而成的物質，葡萄糖聚合物以糖原的形式貯存于肝臟，當饑餓或運動時，可以將其分解成葡萄糖以維持血糖水平[23]。肝糖原的貯存及分解可直接影響運動能力和持續運動時間[24]。因此，血糖濃度和肝糖原含量可以較好地反映疲勞程度[25]。由表3可以看出，與空白組相比，松仁蛋白肽各劑量組血糖濃度和肝糖原含量顯著提高，中、高劑量組小鼠血糖濃度分別為空白組的1.70 倍和2.04 倍，差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；中、高劑量組小鼠肝糖原含量分別為空白組的2.11 倍和2.20 倍，差異極顯著（P＜0.01）。結果表明，PDII可以提高小鼠體內肝糖原的儲備能力，進而維持小鼠運動時的血糖濃度，延緩疲勞。

表3 各實驗組小鼠的生理生化指標Table3 Physiological and biochemical indexes of mice from all groups

當糖原儲存不足時，蛋白質會被分解以提供能量。蛋白質分解產生氨基酸，進一步代謝產生NH3和CO2，導致肝臟中尿素的合成，并通過血液循環和腎臟將尿素排出體外[26-27]。在正常生理條件下，尿素的形成和排泄保持平衡。然而，在長時間運動時，為了滿足能量需求，蛋白質的代謝顯著增加，因此尿素水平顯著上升，過量的尿素會在體內積累并對機體造成危害。血清尿素氮濃度能體現尿素水平的高低，并與運動耐力呈負相關[28]。丙二醛是細胞膜脂質的氧化產物，被認為是脂質過氧化的指標[29]，在疲勞狀態下，丙二醛濃度升高[30]。另外，高強度或長時間運動會增加肌肉的氧氣消耗，導致缺氧，加速糖酵解，并產生大量的酸性物質，如乳酸。這些變化降低了肌肉的pH值和收縮性，改變了體內酸堿平衡，并降低其運動能力[31-32]。因此，乳酸的積累也是身體疲勞的重要因素[33]。由表3可知，與空白組相比，中、高劑量松仁蛋白肽極顯著降低血清尿素氮、丙二醛和乳酸濃度（P＜0.01），具有較強的抗疲勞能力，表明PDII具有降低體內血清尿素氮、丙二醛和乳酸濃度的效果，可以起到延緩疲勞的作用。

3 結 論

本研究利用兩步酶解法獲得具有抗氧化活性和抗疲勞活性的酶解產物。通過超濾、SP Sephadex C-25、Sephadex G-25分離得到組分PDII，對組分PDII分子質量分布進行測定，最終鑒定出PDII的分子質量分布范圍為500～1 100 Da。該組分的羥自由基和DPPH自由基清除能力較強，并且其低、中、高劑量都有維持血糖濃度、提高肝糖原的儲備能力和降低血清尿素氮、丙二醛和乳酸濃度的作用，中、高劑量的PDII具有顯著的抗疲勞作用。