昆侖雪菊水溶性黃酮提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶障礙的改善作用

田 勇，周 督，鄒雙憶，孫星宇，郅 琦，李福香，明 建,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學附屬中學，重慶 400715；3.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

衰老是導致正常細胞調節功能障礙的重要因素，影響神經系統和免疫系統等多個系統[1]，是多種慢性疾病的致病風險因素，包括癌癥、心血管疾病和神經系統退行性疾病等[2]。衰老相關疾病中腦老化問題日益突出，越來越受到人們關注。腦老化是一種正常的生理現象，若腦老化急劇惡化，會導致病理性的神經系統退行性病變，最典型的是阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），主要癥狀為智力、記憶力、感官定向能力、判斷力、語言思維能力不可逆地進行性退化，并常伴有認知和行為障礙[3-4]。因此，不斷探索具有預防腦老化、改善記憶認知能力的抗衰老功能性食品，對神經系統退行性疾病的防治具有重大意義。

昆侖雪菊，又名兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria），屬菊科金雞菊屬類一年生草本植物，原產于北美洲，現分布于世界各地。在中國廣泛種植于新疆維吾爾自治區的高原積雪地區（海拔3 000 m以上），又被稱為“雪菊”[5]。昆侖雪菊含有黃酮、有機酸、萜類、皂苷等多種生物活性成分，其中黃酮類化合物含量最為豐富[5-6]。昆侖雪菊用作茶飲主要的生物活性集中水溶性部分，且黃酮類化合物是其水提取物中的主要生物活性成分[7]。昆侖雪菊黃酮具有降血脂[8]、降血糖[9]、抗氧化[10-11]、抗炎[12-13]、降血壓和舒張血管[14-15]等生物活性；同時，有研究發現昆侖雪菊黃酮具有良好的抗衰老[16-17]和抗神經退行性病變的功效[18]，但作用機制尚不清楚。因此，本實驗以D-半乳糖致衰老小鼠模型，研究昆侖雪菊水溶性黃酮提取物（water soluble flavonoids from Coreopsis tinctoria flowers，CTWF）對衰老小鼠學習記憶能力的影響，并從膽堿能系統功能和氧自由基損傷方面探討其作用機制，以期為昆侖雪菊藥食功能的進一步開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明種小鼠：雌、雄各半，體質量（20±2）g，購自重慶中藥研究院（動物合格證號：0005580）。動物全程飼養于西南大學藥學院清潔級動物房（實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2014-0002）。

昆侖雪菊（Coreopsis tinctoria）采摘于新疆昆侖山海拔3 000 m以上的高寒地區，經新疆維吾爾自治區中醫院藥劑科趙生俊主任醫師鑒定。

乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘆丁、綠原酸、兒茶素、花旗松素、D-半乳糖美國Sigma公司；黃諾馬苷、馬里苷 法國Extrasynthése公司；PH1714印度墨汁 福州飛凈生物科技有限公司；VE、生理鹽水、無水乙醇等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Morris MT-200型水迷宮 成都泰盟科技有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；JS10型手持勻漿機 揚州均瑞機械設備有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；synegyH1MG型酶標儀 美國基因公司；VIS-722型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CTWF的制備與組分分析

1.3.1.1 CTWF的制備

參照Zhang Weixin等[17]的方法制備CTWF，并根據實驗條件稍作修改。在裝有10 g昆侖雪菊的燒杯中加入100 mL蒸餾水并在沸騰的水浴鍋中浸提3 次，每次30 min。所有浸提液抽濾后合并，減壓旋轉蒸發濃縮后凍干成粉。CTWF凍干粉的得率為（43.60±1.78）%。CTWF為膠狀棕褐色固體，經鑒定其主要活性成分為黃酮類化合物[19]。

1.3.1.2 CTWF中總黃酮含量測定

參照吳瑛等[20]的方法，以蘆丁為標準溶液，以吸光度（y）為縱坐標，蘆丁標準溶液質量濃度（x/（μg/mL））為橫坐標，繪制標準曲線。

CTWF中總黃酮含量的測定：移取1 mL稀釋適當倍數的樣品溶液，以不加樣品溶液為空白，按制作蘆丁標準曲線的步驟處理后，在510 nm波長處測得吸光度，代入標準曲線，計算出CTWF中總黃酮含量。

1.3.1.3 HPLC法鑒定分析CTWF中的活性成分

參照Liang Qiang等[21]的方法，稍作修改。采用BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為乙腈、B為體積分數0.1%甲酸溶液，梯度洗脫（0～5 min，10% A；5～50 min，10%～40% A；50～55 min，40%～10% A；55～60 min，10% A）；流速0.7 mL/min；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；檢測器為LC-20A二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）；色譜數據在200～600 nm范圍內掃描，檢測波長280 nm。根據保留時間、液相紫外色譜圖和外標法定性定量分析CTWF中的活性成分。

1.3.2 動物分組及給藥處理

小鼠飼養環境為溫度（25±3）℃，相對濕度（40±10）%，12 h晝夜交替，自由飲食飲水。60 只小鼠適應性喂養5 d后，按體質量隨機分為5 組（每組12 只，雌、雄各半）：正常對照組（normal control，NC）、模型組（model control，MC）、VE陽性對照組（VE positive control，PC）、CTWF低劑量組（low dose of CTWF-treated group，CTWF-L）和CTWF高劑量組（high dose of CTWF-treated group，CTWF-H）。除NC組外，其余各組小鼠頸背部皮下注射滅菌D-半乳糖液（CTWF灌胃劑量300 mg/kg，灌胃體積0.2 mL/10 g）構建衰老模型[16]，NC組注射等體積量的滅菌生理鹽水，連續注射42 d。造模1 h后，藥物組（CTWF-L、CTWF-H）分別以150、600 mg/（kg·d）劑量灌胃CTWF，灌胃體積為0.2 mL/10 g；PC組以50 mg/（kg·d）劑量等體積灌胃VE溶液；NC、MC組灌胃等體積量滅菌生理鹽水，連續灌胃42 d。實驗期間每7 d稱質量1次，按體質量變化調整注射及灌胃劑量。

1.3.3 Morris水迷宮實驗

小鼠末次給藥后進行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮主要由圓形水池（直徑80 cm、高度30 cm）和可移動平臺（直徑10 cm、高度28 cm）組成，水池連接著一個數字攝像機和一臺計算機用于記錄和分析實驗數據。實驗時將迷宮均等分為4 個象限，平臺固定放置在第一象限中央，注入水后加入對小鼠無害的印度墨汁，使小鼠看不到隱藏在水中的平臺，水面高出平臺1～2 cm，水溫保持25 ℃左右。Morris水迷宮實驗包括2部分：定位航行實驗和空間探索實驗[22]。

定位航行實驗：評價衰老小鼠空間學習記憶能力。第一次實驗開始前，讓小鼠自由游泳2 min以適應周圍環境。正式實驗開始時，選擇第二、三、四象限的池壁中點作為入水點，將動物面朝池壁輕輕放入水中，避免應激和將小鼠頭部浸入水中。小鼠有120 s的時間尋找平臺，小鼠在平臺上停留超過2 s判斷為尋找平臺成功，所需的時間記作潛伏期。若小鼠在120 s內找到平臺，使其在平臺上停留30 s記憶平臺位置，并記錄其潛伏期；若小鼠在120 s內未成功找到平臺，則用手將其引至平臺，放置30 s，使得小鼠記憶平臺位置，記錄其潛伏期為120 s。每天上下午各進行1 次訓練，每次為1 個時段，進行3 d，共6 個時段。記錄每個時段小鼠找到平臺所需的潛伏期。

空間探索實驗：評價衰老小鼠空間位置記憶保持能力。定位航行實驗結束后，移去平臺，將小鼠從第二、三、四象限的某一點面向池壁放入水中，記錄其在120 s內穿越目標象限（原平臺所在第一象限）的次數，即穿越次數。

1.3.4 腦組織SOD、GSH-Px、AchE活力及MDA、Ach含量的測定

Morris測試完成后，小鼠禁食不禁水24 h，頸椎脫臼處死，取腦組織以1∶9（m/V）的比例加入預凍滅菌生理鹽水，用手持勻漿機反復勻漿制成質量分數10%組織勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書所示，測定腦組織AchE、SOD、GSH-Px活力及Ach、MDA含量。

1.4 數據統計

采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，所有結果表示為±s，并采用單因素ANOVA和Duncan多重比較分析，P＜0.05表明差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CTWF的HPLC分析

2.1.1 CTWF主要成分的定性分析

圖1 標準品與CTWF色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substances and CTWF

通過比對標準品與樣品的保留時間和液相紫外色譜圖定性分析CTWF的主要成分[21]。如圖1所示，CTWF包含綠原酸、黃諾馬苷、兒茶素、花旗松素和馬里苷，說明CTWF的主要活性成分由酚酸和黃酮類化合物組成，其中黃酮類化合物種類更多。同時，CTWF的色譜峰還有較多未被鑒定出來，仍需進一步研究。

2.1.2 CTWF主要成分的定量分析

表1 CTWF中各組分的保留時間、回歸方程、相關系數和含量Table1 Retention times, linear equations, correlation coeff i cients and contents of CTWF

通過外標法定量分析CTWF的主要成分[13]。如表1所示，CTWF中黃諾馬苷含量最高，為（74.40±3.27）mg/g，其次是馬里苷（（5 3.2 5±1.3 1）m g/g）、兒茶素（（6.6 2±0.0 8）m g/g）、花旗松素（（6.3 6±0.1 4）m g/g）和綠原酸（（3.97±0.03）mg/g），說明CTWF富含多酚，其中黃酮類化合物含量最高。同時，CTWF的總黃酮含量較高，為（314.97±26.16）mg/g。以上結果說明，CTWF發揮活性功能的物質基礎主要是黃酮類化合物。

2.2 CTWF對小鼠體質量的影響

表2 CTWF對D-半乳糖致衰老小鼠體質量的影響（n＝12）Table2 Effect of CTWF on body mass of D-galactose-induced aging mice （n= 12）

在衰老造模期間，小鼠體質量的增長變化情況是反映其生長發育及健康狀況的重要指標之一[23]。如表2所示，各組小鼠之間初始體質量無顯著差異（P＞0.05），而隨著實驗的進行，各組小鼠體質量均有所增加。通過灌胃CTWF后，對各個時間點小鼠體質量數據進行統計分析表明：從第7天開始，MC組小鼠體質量顯著低于NC組（P＜0.05），并且差異隨時間延長呈逐漸增大的趨勢。從第7天開始，CTWF-L組小鼠體質量與NC組相比出現顯著性差異（P＜0.05）。整個實驗過程中，PC、CTWF-H組小鼠體質量與NC組相比無顯著性差異（P＞0.05），說明CTWF對小鼠生長發育無不良影響。

2.3 CTWF對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響

2.3.1 CTWF對小鼠Morris水迷宮尋找平臺潛伏期的影響

圖2 CTWF對小鼠在訓練過程中尋找平臺潛伏期的影響Fig.2 Effect of CTWF on escape latency of mice during training

Morris水迷宮定位航行實驗結果如圖2所示，隨著訓練次數的增加，各組小鼠找到隱蔽平臺所需的時間（即潛伏期）逐漸縮短。從第2次訓練開始，MC組小鼠潛伏期顯著長于NC組（P＜0.01），說明D-半乳糖致衰老小鼠空間學習記憶能力損傷，即造模成功。而PC組和CTWF-H組小鼠較MC組，其潛伏期在時段2～6期間均顯著縮短（P＜0.01，P＜0.05），并在時段6時效果最明顯（P＜0.01）。CTWF-L對衰老模型小鼠學習記憶障礙有一定的改善作用（P＜0.01，P＜0.05），但效果比CTWF-H差。以上結果說明CTWF具有改善衰老模型小鼠空間學習記憶功能的作用。

2.3.2 CTWF對小鼠Morris穿越目標象限次數的影響

圖3 CTWF對小鼠穿越目標象限次數的影響Fig.3 Effect of CTWF on crossing number of mice during training

小鼠水迷宮訓練6 次以后撤掉平臺，測試各組小鼠的空間探索能力，從而反映小鼠的記憶保持能力。如圖3所示，小鼠穿越目標象限次數具有組間差異。與NC組小鼠相比，MC組穿越次數顯著減少（P＜0.05），說明D-半乳糖致衰老模型小鼠空間位置記憶保持能力受損，即造模成功。PC組、CTWF-L組和CTWF-H組小鼠穿越目標象限的次數均比MC組顯著增多（P＜0.05），說明CTWF具有提升衰老模型小鼠記憶保持能力的作用。

2.4 CTWF對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織膽堿能系統功能的影響

表3 CTWF對衰老小鼠腦組織Ach含量及AchE活力的影響（n＝ 12）Table3 Effect of CTWF on Ach content and AchE activity in brain tissues of aging mice （n= 12）

如表3所示，與NC組相比，D-半乳糖處理導致MC組小鼠腦組織中Ach含量顯著降低（P＜0.05），說明造模成功。與MC組相比，CTWF-H及VE處理組小鼠腦組織內Ach含量顯著增加（P＜0.05），而CTWF-L處理對腦組織中Ach含量有一定提升作用但不顯著（P＞0.05）。

此外，與NC組相比，MC組小鼠AchE活力顯著增加（P＜0.05），說明造模成功。與MC組相比，CTWF-H組小鼠腦組織AchE活力顯著降低并恢復到正常水平（P＜0.05）。CTWF-L和VE處理使得衰老小鼠腦組織中AchE活力呈降低趨勢，但不顯著（P＞0.05）。以上結果說明CTWF的抗衰老作用與提升衰老小鼠腦組織膽堿能系統功能有關。

2.5 CTWF對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織抗氧化指標的影響

表1 CTWF對衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響（n＝12）Table1 Effect of CTWF on SOD and GSH-Px activities and MDA content in brain tissues of aging mice （n= 12）

如表4所示，與NC組相比，D-半乳糖誘導的衰老模型組小鼠腦組織中SOD和GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），說明造模成功。與MC組相比，PC組和CTWF-L組的SOD活力有所增加但不顯著（P＞0.05），CTWF-H組的SOD活力顯著增加（P＜0.05）；與MC組相比，VE和CTWF藥物處理均能顯著增加衰老小鼠腦組織GSH-Px活力（P＜0.05），且CTWF呈劑量依賴關系；與MC組相比，PC、CTWF-L和CTWF-H組小鼠腦組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05），且CTWF呈劑量依賴關系。以上結果說明CTWF的抗衰老作用與提升衰老小鼠腦組織抗氧化酶活力和降低脂質過氧化相關。

3 討 論

小鼠長期注射D-半乳糖（50～500 mg/（kg·d），6～8 周）會導致其體內過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積，抗氧化酶活力降低，線粒體和神經元損傷，并常伴隨有認知障礙和學習記憶障礙，引起與自然衰老和正常腦老化相似的衰老現象[24-25]。因此，D-半乳糖注射已被逐漸接受為腦老化研究或抗衰老藥理學研究中建立衰老模型的方法[23-26]。本研究選用昆明小鼠皮下注射D-半乳糖（300 mg/（kg·d））造模，造模時間為42 d。在造模期間，空白對照組和藥物處理組小鼠精神狀態良好、毛色光滑、皮膚有彈性、活動敏捷、食欲良好且體質量增長正常，模型組小鼠造模后出現精神萎靡、反應遲鈍、皮膚松弛、毛色灰暗粗糙、脫毛炸毛現象且體質量增長緩慢；同時，D-半乳糖致衰老模型組小鼠的各評價指標均顯著區別于正常組（P＜0.05），表明構建衰老模型成功。

Morris水迷宮是由Richard Morris于1984年開發并逐步完善，用于研究腦損傷動物模型學習和記憶認知能力的一種行為學測試方法[27]。本研究采用Morris水迷宮評價CTWF對衰老小鼠學習記憶能力的影響。實驗結果表明，衰老模型組小鼠的潛伏期在6 次訓練過程中的縮短程度和撤去平臺后穿越目標象限的次數均顯著低于正常組（P＜0.05），說明D-半乳糖造模導致小鼠學習記憶能力嚴重受損。通過藥物處理干預后，VE陽性對照組和CTWF高、低劑量組小鼠較衰老模型組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05，P＜0.01），穿越目標象限的次數顯著增加（P＜0.05），表明CTWF可以起到改善衰老小鼠學習記憶功能障礙的作用，減緩腦老化。

人和動物的大腦學習記憶認知能力與膽堿能系統功能密切相關，腦組織中的Ach在調節學習記憶功能中發揮主要作用[1,4,28]。隨著老化的發生，腦內Ach含量也隨著減少，導致學習記憶能力的減退。AchE是反映膽堿能系統功能的一種特定蛋白酶，它能把突觸間隙中的Ach降解使其含量降低[29]。因此，提高腦內Ach水平和降低AchE活力，從而提升腦內膽堿能系統功能可能是抗衰老和改善學習記憶能力的作用機理之一。本研究結果表明，模型組小鼠腦組織中的Ach含量和AchE活力均顯著區別于正常組（P＜0.05），說明D-半乳糖致衰老小鼠膽堿能系統功能降低。長期灌胃適當濃度的CTWF可提高衰老小鼠腦組織中Ach含量（P＜0.05），降低AchE活力（P＜0.05），表明CTWF可能通過改善膽堿能系統功能而發揮減緩腦老化的作用。

大量研究表明，氧化應激在腦老化、衰老相關性或神經退行性疾病的發病機制中發揮重要作用[1,3,30]。隨著衰老的加劇，體內ROS積聚，導致細胞大分子物質如DNA、蛋白質和細胞膜脂質發生氧化損傷[31]。腦組織具有高氧需求、高水平不飽和脂質和抗氧化防御機制相對缺乏的特點，更容易受到ROS的攻擊，從而加劇腦老化[1]。因此，抗氧化干預可能是防治神經退行性疾病的重要途徑。SOD和GSH-Px是體內重要的天然抗氧化酶，發揮機體抗氧化防御體系功能，可以有效抑制機體ROS的生成，間接反映機體清除自由基、免受氧化損傷的能力[32]。MDA是脂質過氧化的最終產物，其含量的高低直接反映機體脂質過氧化水平，代表組織受自由基損傷程度[33]。本研究結果表明，D-半乳糖致衰老小鼠腦內SOD、GSH-Px活力明顯降低（P＜0.05），MDA含量顯著增加（P＜0.05）；CTWF灌胃處理能不同程度提高衰老小鼠腦組織SOD和GSH-Px活力，顯著降低MDA含量（P＜0.05），表明CTWF在清除氧自由基和抗氧化方面著發揮重要作用。

綜上所述，CTWF具有明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶障礙的作用，其可能由兩方面共同發揮作用：一方面提高腦組織Ach含量和降低AchE活力，從而提升膽堿能系統功能；另一方面提高腦組織SOD、GSH-Px活力和降低MDA含量，從而減少自由基氧化損傷。

4 結 論

本研究探討了CTWF對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響及其作用機制。結果表明CTWF對小鼠生長發育無不良影響；CTWF能顯著改善D-半乳糖致衰老小鼠的空間探索能力及學習記憶能力（P＜0.05，P＜0.01）；CTWF能有效改善衰老小鼠腦組織膽堿能系統功能（顯著提高Ach含量，顯著降低AchE活力（P＜0.05）），顯著抑制腦組織氧化應激水平（顯著提高SOD和GSH-Px活力，顯著降低MDA含量（P＜0.05））。以上結果可以得出結論：CTWF具有明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶障礙的作用，其機制可能與提高腦組織膽堿能系統功能和減少自由基損傷有關，同時說明昆侖雪菊可以作為一種潛在的抗衰老和益智食品，具有良好的應用開發前景。