云南小?？Х阮?lèi)黑精的抗氧化及減肥功能

王 瑤，王曉娜，張雪輝，殷建忠，潘紅梅，吳志霜，馮月梅，吳少雄*，王松梅*

（昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500）

咖啡原產(chǎn)于非洲埃塞俄比亞，從植物學(xué)上來(lái)說(shuō)，是茜草科咖啡屬，最早對(duì)其進(jìn)行食用和栽培的是阿拉伯人[1]。國(guó)際上通常根據(jù)咖啡果實(shí)顆粒的大小，將咖啡的三大原種劃分為大粒種咖啡、中粒種咖啡、小粒種咖啡[2]。中國(guó)有98%的咖啡出自云南。云南種植的主要是小?？Х龋哂小皾舛豢?、香而不烈、略帶果酸味”的獨(dú)特特點(diǎn)。云南小?？Х纫蚱洫?dú)特的風(fēng)味而深受消費(fèi)者喜愛(ài)，隨著人們生活水平、健康意識(shí)的提升，云南小?？Х鹊幕钚猿煞旨捌渖砉δ芤矀涫懿毮?。然而不同烘焙度咖啡的香氣和口感也不一樣，一般認(rèn)為烘焙程度較低時(shí)，咖啡口感較酸，烘焙程度較高，咖啡口感較苦，適合的烘焙程度，能釋放出咖啡豆的最大香氣。周斌等[3]的研究表明，云南小?？Х炔捎弥泻姹憾葧r(shí)口感和香氣較好。

咖啡類(lèi)黑精是咖啡豆在烘焙過(guò)程中，咖啡豆中的羰基和氨基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)所形成的一類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、聚合度不等的棕褐色、大分子聚合物的混合體[4-5]。由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，Bekedam等[6-7]在研究咖啡類(lèi)黑精分子結(jié)構(gòu)時(shí)，采用美拉德反應(yīng)中間體的結(jié)構(gòu)性能模型系統(tǒng)，將咖啡類(lèi)黑精分為低分子質(zhì)量（＜3 kDa）和高分子質(zhì)量（＞12 kDa）類(lèi)黑精，發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量類(lèi)黑精中含有咖啡因、綠原酸和一些含氮小分子物質(zhì)，高分子質(zhì)量類(lèi)黑精中含有阿拉伯半乳聚糖、酚基、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。在功能研究中，通常使用＜10 kDa濾膜超濾分離類(lèi)黑精來(lái)研究其功能，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量＜10 kDa咖啡類(lèi)黑精具有抗氧化、降血壓、抗菌活性、改善腸道微環(huán)境和結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)等功能[8-12]。分子質(zhì)量＞10 kDa的類(lèi)黑精抗氧化功能尚未受到關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于云南小粒咖啡多為其咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等生物活性物質(zhì)功能的研究；烘焙條件、萃取方法對(duì)咖啡豆揮發(fā)性成分分析；烘焙條件、種植環(huán)境對(duì)云南小粒咖啡感官、品質(zhì)的影響，針對(duì)云南小?？Х阮?lèi)黑精生理功能的報(bào)道較少。為研究云南小粒咖啡類(lèi)黑精減肥降脂功能及不同分子質(zhì)量產(chǎn)物抗氧化能力差異，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取云南小?？Х阮?lèi)黑精及不同分子質(zhì)量產(chǎn)物（＜10、10～100、＞100 kDa），用羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除力和總還原力來(lái)評(píng)價(jià)類(lèi)黑精及分級(jí)產(chǎn)物抗氧化能力差異；運(yùn)用大鼠構(gòu)建肥胖模型，研究類(lèi)黑精的減肥降脂功能，以期為云南小?？Х犬a(chǎn)品及功能食品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

選用清潔級(jí)雄性SD大鼠70 只，體質(zhì)量（260±20）g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）2015-0002?；A(chǔ)詞料：從昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)置，依照GB 14924.3—2010 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》[13]配制，每1 kg基礎(chǔ)飼料主要含碳水化合物550 g、脂肪50 g、灰分70 g、蛋白質(zhì)220 g、纖維素50 g。高熱量飼料為實(shí)驗(yàn)室配制，參照“國(guó)食藥監(jiān)?；痆2012]107號(hào)”附件8《減肥功能評(píng)價(jià)方法》高熱量模型飼料配方，每5 kg高熱量飼料按基礎(chǔ)詞料3.5 kg、蔗糖0.75 kg、豬油0.75 kg配比制成，烘干待用。

中烘焙度的云南小?？Х榷?，均從云南本土市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

二氯甲烷、抗壞血酸、無(wú)水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、乙醚、甲醛、二甲苯、無(wú)水硫酸鈉、DPPH 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722分光光度計(jì)、CT14D11臺(tái)式高速離心機(jī)、732型紫外分光光度計(jì)、全自動(dòng)樣品快速研磨儀、冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；Minimate切向流超濾系統(tǒng)美國(guó)頗爾公司；415R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Cobas c 311全自動(dòng)生化分析儀 德國(guó)羅氏診斷有限公司；RM2235切片機(jī)、ASP300S脫水機(jī)、DM750顯微鏡德國(guó)LEICA公司。

1.3 方法

1.3.1 咖啡類(lèi)黑精的提取分離及純化

提取參考Bekedam等[14]的方法并加以改進(jìn)，稱(chēng)取中烘焙度的云南小?？Х榷?00 g，用粉碎機(jī)粉碎至粒徑0.2～0.4 mm顆粒，備用。將研磨好的咖啡粉30 g添加到90 ℃的180 g去離子水中，并在90 ℃水浴中連續(xù)攪拌15 min，冷卻后用布氏漏斗過(guò)濾，濾液用二氯甲烷脫脂，于40 ℃水浴鍋中去除二氯甲烷后，將樣品預(yù)凍后用冷凍干燥機(jī)制成凍干樣品并稱(chēng)其質(zhì)量，過(guò)濾后的咖啡渣重復(fù)上述操作3 次。

將中烘焙度的云南小?？Х阮?lèi)黑精樣品（M總）配制成2 g/100 mL的溶液，用0.2 μm的濾膜片過(guò)濾后，分別用100、10 kDa的濾膜分級(jí)截留得到截留液和濾出液[15]，濾出液重復(fù)超濾4 次，每次吸取截留液后用10 mL去離子水洗濾3 次，以減少樣品殘留，將最終收集的截留液和濾出液預(yù)凍后冷凍干燥，分別得到分子質(zhì)量為＞100、10～100、＜10 kDa的咖啡類(lèi)黑精M1、M2、M3。

以二氯甲烷為溶劑，用索氏提取器進(jìn)行純化，脫除類(lèi)黑精樣品中的咖啡因[16]。將提取的中烘焙度云南小?？Х阮?lèi)黑精樣品放入索氏提取器的濾紙筒中，加入30 mL二氯甲烷，再向圓底燒瓶中加入80 mL二氯甲烷，42 ℃水浴加熱回流提取8 h，隨后更換新的二氯甲烷80 mL，再繼續(xù)抽提，當(dāng)濾紙筒邊緣不析出白色晶體時(shí)，結(jié)束回流提取，揮發(fā)干類(lèi)黑精樣品中的二氯甲烷，待用。

1.3.2 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參考其他物質(zhì)DPPH自由基清除力測(cè)定方法[17-21]，精密稱(chēng)取DPPH 78.9 mg，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，搖勻后得到濃度為4 mmol/L的DPPH母液。使用時(shí)將DPPH母液用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)ぷ饕簼舛葹?.1 mmol/L。將不同分子質(zhì)量樣品用無(wú)水乙醇稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的溶液，取不同質(zhì)量濃度樣品溶液2 mL，于EP管中進(jìn)行以下3 組反應(yīng)：2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH溶液混合；2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液混合；2 mL樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合。分別搖勻，避光反應(yīng)30 min。使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各體系吸光度[17-21]。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3 次，取平均值，根據(jù)式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為2 mL乙醇與2 mL DPPH溶液的吸光度；A1為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液的吸光度；A2為2 mL樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.3.3 清除羥自由基能力測(cè)定

參考其他物質(zhì)羥自由基清除能力測(cè)定方法[22-27]，將不同分子質(zhì)量樣品用蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的溶液，取5 支試管，依次標(biāo)記為1～5，各試管中分別加入不同質(zhì)量濃度樣液2 mL，再按順序依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL啟動(dòng)反應(yīng)，室溫反應(yīng)1 h后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各待測(cè)液的吸光度AX，以蒸餾水為空白對(duì)照A0，考慮到樣品本身的吸光度，另取5 支試管，各試管中分別加入不同質(zhì)量濃度樣液2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，最后以2 mL去離子水代替8.8 mmol/L H2O2溶液，為類(lèi)黑精的本底吸光度AX0，根據(jù)式（2）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；AX為加入類(lèi)黑精后的吸光度；AX0為不加H2O2的類(lèi)黑精溶液本底吸光度。

1.3.4 總還原力測(cè)定

參考Benjakul等[28]的方法，采用鐵氰化鉀法測(cè)定總還原力。取不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）溶液2.5 mL于離心管中，再依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液、2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，取出后立即用冷水冷卻，并加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，混勻后于5 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液，混勻室溫靜置10 min，700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[29]，吸光度越高表示樣品的還原力越強(qiáng)。

1.3.5 咖啡類(lèi)黑精對(duì)肥胖大鼠的減肥作用

1.3.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模

選取精神狀態(tài)良好、無(wú)異常的70 只SD大鼠進(jìn)入動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～65%及光照12 h/d，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，適應(yīng)期結(jié)束后稱(chēng)其體質(zhì)量，參照“國(guó)食藥監(jiān)?；痆2012]107號(hào)”附件8《減肥功能評(píng)價(jià)方法》，按照大鼠體質(zhì)量，將其隨機(jī)分成2 組，其中10 只大鼠作為空白對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，60 只大鼠作為模型組給予高熱量飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周記錄給食量、撒食量、剩食量，稱(chēng)量體質(zhì)量1 次。喂養(yǎng)2 周后，給予高熱量飼料的60 只大鼠按體質(zhì)量增量排序，淘汰1/3體質(zhì)量增量較低的大鼠，對(duì)組內(nèi)余下的40 只大鼠繼續(xù)飼喂高熱量飼料。飼喂6 周后，測(cè)量體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型組的大鼠體質(zhì)量超過(guò)空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量20%，空白對(duì)照組體質(zhì)量和增質(zhì)量與模型組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肥胖模型成功。

1.3.5.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及受試樣品的給予

造模成功后將40 只肥胖大鼠依據(jù)體質(zhì)量按照隨機(jī)區(qū)組法分成4 組，分別是模型組和低、中、高3 個(gè)劑量處理組，各組間大鼠的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型對(duì)照組和3 個(gè)劑量處理組給予高熱量飼料，空白對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料。中度烘焙的云南小?？Х阮?lèi)黑精劑量按人均體質(zhì)量（60 kg）、每天飲用純咖啡30 g、中度焙烤咖啡中熱水提取類(lèi)黑精占咖啡干物質(zhì)的24%計(jì)算。中度烘焙的云南小?？Х阮?lèi)黑精攝入量為120 mg/（kg·d mb），以人體攝入量的5 倍（0.6 g/（kg·d mb））、10 倍（1.2 g/（kg·d mb））、30 倍（3.6 g/（kg·d mb））劑量進(jìn)行灌胃（0.5 mL/100 g），通過(guò)計(jì)算得到低、中、高3 個(gè)劑量處理組樣品質(zhì)量濃度分別為12、24、72 g/100 mL，配制后當(dāng)天使用。

空白對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，灌胃劑量為0.5 mL/100 g。受試樣品給予時(shí)間6 周，每周記錄給食量、撒食量、剩食量，并稱(chēng)量體質(zhì)量1 次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食不禁水16 h，稱(chēng)體質(zhì)量，乙醚麻醉，股動(dòng)脈采血，采血后盡快分離血清，測(cè)定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白-膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）的水平[30]。解剖大鼠，取腹腔脂肪及各臟器并稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算脂體比。大鼠肝臟、腹腔脂肪用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定[31-32]。

1.3.5.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定

體質(zhì)量：每周測(cè)定1 次，反映中度烘焙的云南小?？Х阮?lèi)黑精減肥效果。

Lee’s指數(shù)測(cè)定[31]：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死前在麻醉狀態(tài)下準(zhǔn)確測(cè)量體長(zhǎng)（鼻尖至肛門(mén)外沿的距離），按式（3）計(jì)算肥胖指數(shù)（即Lee’s指數(shù)）。

脂體比：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)在麻醉下立即剖腹取大鼠體脂并稱(chēng)質(zhì)量。脂體比按式（4）計(jì)算。

生化指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠禁食16 h后取血分離血清（血液靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液），用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平[30-31]。

脂肪組織病理形態(tài)學(xué)觀察[32]：取腹腔同一部位脂肪一塊，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，固定完全后，用石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，得到脂肪組織石蠟切片，觀察脂肪組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)，盲法閱片，文件編號(hào)同病理切片編號(hào)。

肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察[32]：取大鼠肝臟同一葉，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，固定完全后，用石蠟包埋切片，HE染色，得到脂肪組織石蠟切片，觀察肝臟組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)，盲法閱片，觀察肝細(xì)胞形態(tài)，文件編號(hào)同病理切片編號(hào)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2010和SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析對(duì)各組間差異進(jìn)行比較，各組間的多重比較采用最小顯著性差異（least signi fi cant difference，LSD）法。

減肥結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)組的體質(zhì)量或體質(zhì)量增加量低于模型對(duì)照組，體脂質(zhì)量或脂體比低于模型對(duì)照組，差異有顯著性，可判定該受試樣品動(dòng)物減肥功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南小?？Х阮?lèi)黑精的提取及抗氧化性

2.1.1 咖啡類(lèi)黑精對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖1 中烘焙度咖啡類(lèi)黑精及其分級(jí)產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of total melanoidins and fractions

如圖1所示，云南小?？Х阮?lèi)黑精中分子質(zhì)量＜10 kDa（M3）對(duì)DPPH自由基的清除效果與未分離的云南小粒咖啡類(lèi)黑精（M總）對(duì)DPPH自由基的清除效果最為相近，均呈現(xiàn)較強(qiáng)的清除能力，云南小?？Х阮?lèi)黑精中分子質(zhì)量＞100 kDa（M1）對(duì)DPPH自由基的清除效果較M總、M2、M3弱?？傮w來(lái)看，質(zhì)量濃度在0.4～0.8 g/L時(shí)，DPPH自由基清除率隨質(zhì)量濃度增加而增加，而0.8～1.0 g/L其清除率呈下降趨勢(shì)。研究報(bào)道，小分子類(lèi)黑精產(chǎn)物呈現(xiàn)較強(qiáng)清除DPPH自由基能力，可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)中形成的色素類(lèi)物質(zhì)提供氫與DPPH反應(yīng)，還可能因?yàn)檫@些小分子化合物以非共價(jià)鍵的形式連接在類(lèi)黑精骨架上，分級(jí)之后小分子物質(zhì)解離出來(lái)暴露更多的羥基，使得清除DPPH的能力增強(qiáng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)云南小粒咖啡小分子質(zhì)量類(lèi)黑精呈現(xiàn)較強(qiáng)的清除DPPH能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)未分級(jí)類(lèi)黑精及分子質(zhì)量為10～100 kDa的類(lèi)黑精均呈現(xiàn)較強(qiáng)清除DPPH自由基能力，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.1.2 咖啡類(lèi)黑精對(duì)羥自由基的清除能力

圖2 中烘焙度咖啡類(lèi)黑精及其分級(jí)產(chǎn)物對(duì)羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging capacity of total melanoidins and fractions

如圖2所示，可知云南小粒咖啡類(lèi)黑精中分子質(zhì)量＜10 kDa（M3）對(duì)羥自由基的清除效果與未分離的咖啡類(lèi)黑精對(duì)羥自由基的清除效果最為相近，云南小?？Х阮?lèi)黑精中分子質(zhì)量＞100 kDa（M1）對(duì)羥自由基的清除能力較M2、M3弱。未分離類(lèi)黑精及分子質(zhì)量為10～100 kDa和＜10 kDa的類(lèi)黑精對(duì)羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，其質(zhì)量濃度在1.0～4.0 g/L內(nèi)呈線性增強(qiáng)。Delgado-Andrade等[33]在咖啡類(lèi)黑精抗氧化研究中發(fā)現(xiàn)，咖啡類(lèi)黑精骨架上小分子復(fù)合物的抗氧化性更強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)除分子質(zhì)量＞100 kDa的類(lèi)黑精以外，其他類(lèi)黑精及其分級(jí)產(chǎn)物均有較強(qiáng)清除羥自由基的能力。提示對(duì)于云南小?？Х龋?lèi)黑精分子質(zhì)量＜100 kDa的產(chǎn)品及功能食品也可以作為未來(lái)開(kāi)發(fā)的關(guān)注點(diǎn)。

2.1.3 咖啡類(lèi)黑精不同分子質(zhì)量的總還原力

圖3 中烘焙度咖啡類(lèi)黑精及其分級(jí)產(chǎn)物的總還原力Fig.3 Reducing power of total melanoidins and fractions

如圖3所示，云南小?？Х阮?lèi)黑精各分子質(zhì)量的吸光度隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，表明其還原力逐漸增強(qiáng)。M3、M2還原力增長(zhǎng)趨勢(shì)與M總一致，在質(zhì)量濃度0.4～1.0 g/L時(shí)其還原力為M3＞M2＞M總＞M1。王忠合等[18]的研究表明，分子質(zhì)量＞10 kDa類(lèi)黑精還原力較強(qiáng)，本研究中發(fā)現(xiàn)云南小粒咖啡類(lèi)黑精及分級(jí)產(chǎn)物均呈現(xiàn)較強(qiáng)還原力，主要可能與類(lèi)黑精能夠絡(luò)合亞鐵離子有關(guān)。

2.2 云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)肥胖大鼠減肥的作用

2.2.1 云南小粒咖啡類(lèi)黑精對(duì)SD大鼠體質(zhì)量的影響

表1 云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)SD大鼠體質(zhì)量的影響Table1 Effect of total melanoidins on body mass of SD rats g

由表1可知，各組初始體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝1.003，P＞0.05）。飼喂高熱量飼料建立肥胖模型，造模結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組與所有飼喂高熱量飼料的組的體質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝12.069，P＜0.01），模型組體質(zhì)量超過(guò)空白對(duì)照組體質(zhì)量的20%，且模型組與空白對(duì)照組體質(zhì)量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），肥胖模型建立成功。

將造模成功的大鼠按體質(zhì)量分為模型組、低劑量處理組、中劑量處理組和高劑量處理組，各組體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝0.143，P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低、中、高劑量處理組的體質(zhì)量與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量處理組、模型組體質(zhì)量與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高劑量處理組體質(zhì)量與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明云南小?？Х阮?lèi)黑精有控制肥胖大鼠體質(zhì)量的作用。研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)黑精具有類(lèi)膳食纖維功能，其發(fā)揮減肥作用可能因?yàn)轭?lèi)黑精在腸道中不被消化吸收，能夠促進(jìn)腸蠕動(dòng)，縮短食物在腸道中的駐留時(shí)間，發(fā)揮類(lèi)膳食纖維功能[34]。云南小粒咖啡類(lèi)黑精發(fā)揮減肥功能的機(jī)制應(yīng)該與此相似。

2.2.2 云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)SD大鼠Lee’s指數(shù)、體脂質(zhì)量及脂體比的影響

表2 云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)SD大鼠Lee’s指數(shù)、體脂質(zhì)量及脂體比的影響Table2 Effect of total melanoidins on Lee’s index, body fat content and body fat ratio of SD rats

由表2可知，模型組與空白對(duì)照組Lee’s指數(shù)、體脂質(zhì)量和脂體比之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組、低、中、高劑量處理組Lee’s指數(shù)與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

在體脂質(zhì)量方面，模型組、低、中劑量處理組與空白對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），高劑量處理組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低、中劑量處理組與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但體脂質(zhì)量有下降的趨勢(shì)。

在脂體比方面，模型組、低、中劑量處理組與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量處理組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，云南小?？Х阮?lèi)黑精能減少體脂含量，可推測(cè)云南小粒咖啡類(lèi)黑精能促進(jìn)脂肪代謝，減少脂肪堆積。

2.2.3 云南小粒咖啡類(lèi)黑精對(duì)SD大鼠血脂水平的影響

由表3可知，各組間TC、TG、LDL-C濃度差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但高劑量處理組的TC、TG濃度均比模型組低。高劑量處理組的HDL-C水平比模型組水平高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明高劑量處理組云南小粒咖啡類(lèi)黑精具有提升大鼠血清HDL-C水平的作用。

表3 中烘焙度的云南小粒咖啡類(lèi)黑精對(duì)SD大鼠血脂水平的影響Table3 Effect of total melanoidins on blood lipid levels of SD rats mmol/L

2.2.4 云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)SD大鼠組織形態(tài)的影響

圖1 SD大鼠脂肪組織形態(tài)圖（100×）Fig.1 Morphology of adipose tissue in SD rats （100 ×）

從脂肪組織切片圖可見(jiàn)，模型組大鼠脂肪細(xì)胞膨大，細(xì)胞中脂肪充盈，單位視野細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞間質(zhì)被脂肪擠壓變?。▓D4B）。受試物低（圖4C）、中（圖4D）、高（圖4E）劑量處理組大鼠脂肪細(xì)胞均有所減小，且排列均勻、結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間隙小動(dòng)脈清晰可見(jiàn)，與空白對(duì)照組（圖4A）的相似，3 個(gè)劑量處理組相比，高劑量處理組大鼠脂肪細(xì)胞較小，形態(tài)與空白對(duì)照組的更接近，表明云南小?？Х阮?lèi)黑精能抑制脂肪細(xì)胞的膨大，減少脂肪的堆積，且高劑量處理組的效果最明顯。

圖5 SD大鼠肝臟組織形態(tài)圖（40×）Fig.5 Liver histomorphology in SD rats （40 ×）

從肝臟組織切片圖可以見(jiàn)，空白對(duì)照組的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈清楚，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝竇正常、肝細(xì)胞大小一致、細(xì)胞核清晰、胞漿均勻（圖5A）；而模型組的肝細(xì)胞正常組織結(jié)構(gòu)消失，肝竇縮小甚至消失，細(xì)胞邊界模糊，肝索排列雜亂，較大面積肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，部分胞漿呈空泡樣（圖5B）；其余各實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞邊界較明顯，空泡面積較少，低劑量處理組（圖5C）與空白對(duì)照組相比肝索排列雜亂，肝細(xì)胞面積大小相似；中劑量處理組（圖5D）和高劑量處理組（圖5E）的形態(tài)與空白對(duì)照組的相似。表明云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟有較好的保護(hù)作用，中劑量處理組和高劑量處理組均有不錯(cuò)的效果。有研究表明類(lèi)黑精中的多酚和綠原酸等物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)胰島素敏感性和其他代謝在肝上的轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)誘導(dǎo)脂肪酸的分解代謝，來(lái)防止脂肪沉積和肝臟損傷[35-36]。Cho等[37]報(bào)道，類(lèi)黑精中的綠原酸能夠增強(qiáng)脂肪酸β-氧化活性促進(jìn)脂肪分解。云南小?？Х阮?lèi)黑精中也存在促進(jìn)脂肪酸代謝和保護(hù)肝損傷的物質(zhì)，與Vitaglione等[32]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

云南小?？Х阮?lèi)黑精及不同分子質(zhì)量產(chǎn)物均有一定清除DPPH自由基和羥自由基的能力。在相同質(zhì)量濃度下，對(duì)DPPH自由基的清除能力由高到低依次為：M總＞M3＞M2＞M1，對(duì)羥自由基的清除能力由高到低依次為：M總＞M3＞M2＞M1。采用鐵氰化鉀測(cè)定類(lèi)黑精及不同分子質(zhì)量產(chǎn)物的總還原力，結(jié)果表明，M總、M1、M2、M3均具備良好的抗氧化活性，總還原力由高到低依次為：M3＞M2＞M總＞M1。

肥胖模型建立成功后，對(duì)肥胖大鼠給予受試樣品，結(jié)果顯示：1）云南小?？Х阮?lèi)黑精具有一定的減肥作用，能抑制大鼠體質(zhì)量的增加及減少肥胖大鼠體脂含量；2）高劑量處理組云南小?？Х阮?lèi)黑精能夠提高大鼠HDL-C水平，對(duì)HDL-C有較好的保護(hù)作用；3）中劑量處理組和高劑量處理組云南小?？Х阮?lèi)黑精對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的肝臟有較好的保護(hù)作用，能促進(jìn)脂肪代謝，能較好地改善肝內(nèi)脂肪堆積的癥狀。