云南小粒咖啡類黑精的抗氧化及減肥功能

王 瑤，王曉娜，張雪輝，殷建忠，潘紅梅，吳志霜，馮月梅，吳少雄*，王松梅*

（昆明醫科大學公共衛生學院，云南 昆明 650500）

咖啡原產于非洲埃塞俄比亞，從植物學上來說，是茜草科咖啡屬，最早對其進行食用和栽培的是阿拉伯人[1]。國際上通常根據咖啡果實顆粒的大小，將咖啡的三大原種劃分為大粒種咖啡、中粒種咖啡、小粒種咖啡[2]。中國有98%的咖啡出自云南。云南種植的主要是小粒咖啡，具有“濃而不苦、香而不烈、略帶果酸味”的獨特特點。云南小粒咖啡因其獨特的風味而深受消費者喜愛，隨著人們生活水平、健康意識的提升，云南小粒咖啡的活性成分及其生理功能也備受矚目。然而不同烘焙度咖啡的香氣和口感也不一樣，一般認為烘焙程度較低時，咖啡口感較酸，烘焙程度較高，咖啡口感較苦，適合的烘焙程度，能釋放出咖啡豆的最大香氣。周斌等[3]的研究表明，云南小粒咖啡采用中烘焙度時口感和香氣較好。

咖啡類黑精是咖啡豆在烘焙過程中，咖啡豆中的羰基和氨基化合物發生美拉德反應所形成的一類結構復雜、聚合度不等的棕褐色、大分子聚合物的混合體[4-5]。由于其結構復雜，Bekedam等[6-7]在研究咖啡類黑精分子結構時，采用美拉德反應中間體的結構性能模型系統，將咖啡類黑精分為低分子質量（＜3 kDa）和高分子質量（＞12 kDa）類黑精，發現低分子質量類黑精中含有咖啡因、綠原酸和一些含氮小分子物質，高分子質量類黑精中含有阿拉伯半乳聚糖、酚基、蛋白質等物質。在功能研究中，通常使用＜10 kDa濾膜超濾分離類黑精來研究其功能，發現分子質量＜10 kDa咖啡類黑精具有抗氧化、降血壓、抗菌活性、改善腸道微環境和結合風味物質等功能[8-12]。分子質量＞10 kDa的類黑精抗氧化功能尚未受到關注。目前，國內關于云南小粒咖啡多為其咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等生物活性物質功能的研究；烘焙條件、萃取方法對咖啡豆揮發性成分分析；烘焙條件、種植環境對云南小粒咖啡感官、品質的影響，針對云南小粒咖啡類黑精生理功能的報道較少。為研究云南小粒咖啡類黑精減肥降脂功能及不同分子質量產物抗氧化能力差異，本實驗通過提取云南小粒咖啡類黑精及不同分子質量產物（＜10、10～100、＞100 kDa），用羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除力和總還原力來評價類黑精及分級產物抗氧化能力差異；運用大鼠構建肥胖模型，研究類黑精的減肥降脂功能，以期為云南小粒咖啡產品及功能食品開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

選用清潔級雄性SD大鼠70 只，體質量（260±20）g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（滇）2015-0002。基礎詞料：從昆明醫科大學實驗動物中心購置，依照GB 14924.3—2010 《實驗動物 配合飼料營養成分》[13]配制，每1 kg基礎飼料主要含碳水化合物550 g、脂肪50 g、灰分70 g、蛋白質220 g、纖維素50 g。高熱量飼料為實驗室配制，參照“國食藥監保化[2012]107號”附件8《減肥功能評價方法》高熱量模型飼料配方，每5 kg高熱量飼料按基礎詞料3.5 kg、蔗糖0.75 kg、豬油0.75 kg配比制成，烘干待用。

中烘焙度的云南小粒咖啡豆，均從云南本土市場購買。

二氯甲烷、抗壞血酸、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、乙醚、甲醛、二甲苯、無水硫酸鈉、DPPH 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

722分光光度計、CT14D11臺式高速離心機、732型紫外分光光度計、全自動樣品快速研磨儀、冷凍干燥機 美國Labconco公司；Minimate切向流超濾系統美國頗爾公司；415R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Cobas c 311全自動生化分析儀 德國羅氏診斷有限公司；RM2235切片機、ASP300S脫水機、DM750顯微鏡德國LEICA公司。

1.3 方法

1.3.1 咖啡類黑精的提取分離及純化

提取參考Bekedam等[14]的方法并加以改進，稱取中烘焙度的云南小粒咖啡豆100 g，用粉碎機粉碎至粒徑0.2～0.4 mm顆粒，備用。將研磨好的咖啡粉30 g添加到90 ℃的180 g去離子水中，并在90 ℃水浴中連續攪拌15 min，冷卻后用布氏漏斗過濾，濾液用二氯甲烷脫脂，于40 ℃水浴鍋中去除二氯甲烷后，將樣品預凍后用冷凍干燥機制成凍干樣品并稱其質量，過濾后的咖啡渣重復上述操作3 次。

將中烘焙度的云南小粒咖啡類黑精樣品（M總）配制成2 g/100 mL的溶液，用0.2 μm的濾膜片過濾后，分別用100、10 kDa的濾膜分級截留得到截留液和濾出液[15]，濾出液重復超濾4 次，每次吸取截留液后用10 mL去離子水洗濾3 次，以減少樣品殘留，將最終收集的截留液和濾出液預凍后冷凍干燥，分別得到分子質量為＞100、10～100、＜10 kDa的咖啡類黑精M1、M2、M3。

以二氯甲烷為溶劑，用索氏提取器進行純化，脫除類黑精樣品中的咖啡因[16]。將提取的中烘焙度云南小粒咖啡類黑精樣品放入索氏提取器的濾紙筒中，加入30 mL二氯甲烷，再向圓底燒瓶中加入80 mL二氯甲烷，42 ℃水浴加熱回流提取8 h，隨后更換新的二氯甲烷80 mL，再繼續抽提，當濾紙筒邊緣不析出白色晶體時，結束回流提取，揮發干類黑精樣品中的二氯甲烷，待用。

1.3.2 清除DPPH自由基能力測定

參考其他物質DPPH自由基清除力測定方法[17-21]，精密稱取DPPH 78.9 mg，用無水乙醇定容至50 mL，搖勻后得到濃度為4 mmol/L的DPPH母液。使用時將DPPH母液用無水乙醇稀釋，工作液濃度為0.1 mmol/L。將不同分子質量樣品用無水乙醇稀釋為質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的溶液，取不同質量濃度樣品溶液2 mL，于EP管中進行以下3 組反應：2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合；2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液混合；2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇混合。分別搖勻，避光反應30 min。使用紫外-可見分光光度計在517 nm波長處測量各體系吸光度[17-21]。實驗平行進行3 次，取平均值，根據式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為2 mL乙醇與2 mL DPPH溶液的吸光度；A1為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液的吸光度；A2為2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.3 清除羥自由基能力測定

參考其他物質羥自由基清除能力測定方法[22-27]，將不同分子質量樣品用蒸餾水溶解，配制成質量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的溶液，取5 支試管，依次標記為1～5，各試管中分別加入不同質量濃度樣液2 mL，再按順序依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL啟動反應，室溫反應1 h后，在510 nm波長處測定各待測液的吸光度AX，以蒸餾水為空白對照A0，考慮到樣品本身的吸光度，另取5 支試管，各試管中分別加入不同質量濃度樣液2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，最后以2 mL去離子水代替8.8 mmol/L H2O2溶液，為類黑精的本底吸光度AX0，根據式（2）計算羥自由基清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度；AX為加入類黑精后的吸光度；AX0為不加H2O2的類黑精溶液本底吸光度。

1.3.4 總還原力測定

參考Benjakul等[28]的方法，采用鐵氰化鉀法測定總還原力。取不同質量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）溶液2.5 mL于離心管中，再依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液、2.5 mL質量分數1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴中反應20 min，取出后立即用冷水冷卻，并加入2.5 mL質量分數10%三氯乙酸溶液，混勻后于5 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數0.1% FeCl3溶液，混勻室溫靜置10 min，700 nm波長處測定其吸光度[29]，吸光度越高表示樣品的還原力越強。

1.3.5 咖啡類黑精對肥胖大鼠的減肥作用

1.3.5.1 實驗動物造模

選取精神狀態良好、無異常的70 只SD大鼠進入動物房，飼養環境：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～65%及光照12 h/d，基礎飼料適應性飼養7 d，適應期結束后稱其體質量，參照“國食藥監保化[2012]107號”附件8《減肥功能評價方法》，按照大鼠體質量，將其隨機分成2 組，其中10 只大鼠作為空白對照組給予基礎飼料，60 只大鼠作為模型組給予高熱量飼料。實驗過程中，每周記錄給食量、撒食量、剩食量，稱量體質量1 次。喂養2 周后，給予高熱量飼料的60 只大鼠按體質量增量排序，淘汰1/3體質量增量較低的大鼠，對組內余下的40 只大鼠繼續飼喂高熱量飼料。飼喂6 周后，測量體質量進行統計分析，模型組的大鼠體質量超過空白對照組大鼠體質量20%，空白對照組體質量和增質量與模型組相比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），肥胖模型成功。

1.3.5.2 實驗動物的分組及受試樣品的給予

造模成功后將40 只肥胖大鼠依據體質量按照隨機區組法分成4 組，分別是模型組和低、中、高3 個劑量處理組，各組間大鼠的體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。模型對照組和3 個劑量處理組給予高熱量飼料，空白對照組給予基礎飼料。中度烘焙的云南小粒咖啡類黑精劑量按人均體質量（60 kg）、每天飲用純咖啡30 g、中度焙烤咖啡中熱水提取類黑精占咖啡干物質的24%計算。中度烘焙的云南小粒咖啡類黑精攝入量為120 mg/（kg·d mb），以人體攝入量的5 倍（0.6 g/（kg·d mb））、10 倍（1.2 g/（kg·d mb））、30 倍（3.6 g/（kg·d mb））劑量進行灌胃（0.5 mL/100 g），通過計算得到低、中、高3 個劑量處理組樣品質量濃度分別為12、24、72 g/100 mL，配制后當天使用。

空白對照組和模型組給予生理鹽水，灌胃劑量為0.5 mL/100 g。受試樣品給予時間6 周，每周記錄給食量、撒食量、剩食量，并稱量體質量1 次。

實驗結束時禁食不禁水16 h，稱體質量，乙醚麻醉，股動脈采血，采血后盡快分離血清，測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白-膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）的水平[30]。解剖大鼠，取腹腔脂肪及各臟器并稱質量，計算脂體比。大鼠肝臟、腹腔脂肪用體積分數10%甲醛溶液固定[31-32]。

1.3.5.3 觀察指標及測定

體質量：每周測定1 次，反映中度烘焙的云南小粒咖啡類黑精減肥效果。

Lee’s指數測定[31]：實驗終點處死前在麻醉狀態下準確測量體長（鼻尖至肛門外沿的距離），按式（3）計算肥胖指數（即Lee’s指數）。

脂體比：實驗終點在麻醉下立即剖腹取大鼠體脂并稱質量。脂體比按式（4）計算。

生化指標：實驗結束時，各組大鼠禁食16 h后取血分離血清（血液靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液），用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平[30-31]。

脂肪組織病理形態學觀察[32]：取腹腔同一部位脂肪一塊，用體積分數10%甲醛溶液固定，固定完全后，用石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，得到脂肪組織石蠟切片，觀察脂肪組織細胞形態學，盲法閱片，文件編號同病理切片編號。

肝臟病理形態學觀察[32]：取大鼠肝臟同一葉，用體積分數10%甲醛溶液固定，固定完全后，用石蠟包埋切片，HE染色，得到脂肪組織石蠟切片，觀察肝臟組織細胞形態學，盲法閱片，觀察肝細胞形態，文件編號同病理切片編號。

1.4 數據統計與分析

用Excel 2010和SPSS 22.0軟件對實驗數據進行處理和分析，實驗數據用±s表示，采用單因素方差分析對各組間差異進行比較，各組間的多重比較采用最小顯著性差異（least signi fi cant difference，LSD）法。

減肥結果判定：實驗組的體質量或體質量增加量低于模型對照組，體脂質量或脂體比低于模型對照組，差異有顯著性，可判定該受試樣品動物減肥功能實驗結果陽性。

2 結果與分析

2.1 云南小粒咖啡類黑精的提取及抗氧化性

2.1.1 咖啡類黑精對DPPH自由基的清除作用

圖1 中烘焙度咖啡類黑精及其分級產物對DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of total melanoidins and fractions

如圖1所示，云南小粒咖啡類黑精中分子質量＜10 kDa（M3）對DPPH自由基的清除效果與未分離的云南小粒咖啡類黑精（M總）對DPPH自由基的清除效果最為相近，均呈現較強的清除能力，云南小粒咖啡類黑精中分子質量＞100 kDa（M1）對DPPH自由基的清除效果較M總、M2、M3弱。總體來看，質量濃度在0.4～0.8 g/L時，DPPH自由基清除率隨質量濃度增加而增加，而0.8～1.0 g/L其清除率呈下降趨勢。研究報道，小分子類黑精產物呈現較強清除DPPH自由基能力，可能是因為美拉德反應中形成的色素類物質提供氫與DPPH反應，還可能因為這些小分子化合物以非共價鍵的形式連接在類黑精骨架上，分級之后小分子物質解離出來暴露更多的羥基，使得清除DPPH的能力增強[18]。本研究發現云南小粒咖啡小分子質量類黑精呈現較強的清除DPPH能力，同時發現未分級類黑精及分子質量為10～100 kDa的類黑精均呈現較強清除DPPH自由基能力，具體機制有待進一步研究。

2.1.2 咖啡類黑精對羥自由基的清除能力

圖2 中烘焙度咖啡類黑精及其分級產物對羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging capacity of total melanoidins and fractions

如圖2所示，可知云南小粒咖啡類黑精中分子質量＜10 kDa（M3）對羥自由基的清除效果與未分離的咖啡類黑精對羥自由基的清除效果最為相近，云南小粒咖啡類黑精中分子質量＞100 kDa（M1）對羥自由基的清除能力較M2、M3弱。未分離類黑精及分子質量為10～100 kDa和＜10 kDa的類黑精對羥自由基的清除能力隨質量濃度的增加而增強，其質量濃度在1.0～4.0 g/L內呈線性增強。Delgado-Andrade等[33]在咖啡類黑精抗氧化研究中發現，咖啡類黑精骨架上小分子復合物的抗氧化性更強。本研究發現除分子質量＞100 kDa的類黑精以外，其他類黑精及其分級產物均有較強清除羥自由基的能力。提示對于云南小粒咖啡，類黑精分子質量＜100 kDa的產品及功能食品也可以作為未來開發的關注點。

2.1.3 咖啡類黑精不同分子質量的總還原力

圖3 中烘焙度咖啡類黑精及其分級產物的總還原力Fig.3 Reducing power of total melanoidins and fractions

如圖3所示，云南小粒咖啡類黑精各分子質量的吸光度隨著樣品質量濃度的增加而逐漸增大，表明其還原力逐漸增強。M3、M2還原力增長趨勢與M總一致，在質量濃度0.4～1.0 g/L時其還原力為M3＞M2＞M總＞M1。王忠合等[18]的研究表明，分子質量＞10 kDa類黑精還原力較強，本研究中發現云南小粒咖啡類黑精及分級產物均呈現較強還原力，主要可能與類黑精能夠絡合亞鐵離子有關。

2.2 云南小粒咖啡類黑精對肥胖大鼠減肥的作用

2.2.1 云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠體質量的影響

表1 云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠體質量的影響Table1 Effect of total melanoidins on body mass of SD rats g

由表1可知，各組初始體質量無統計學差異（F＝1.003，P＞0.05）。飼喂高熱量飼料建立肥胖模型，造模結束時，空白對照組與所有飼喂高熱量飼料的組的體質量有統計學差異（F＝12.069，P＜0.01），模型組體質量超過空白對照組體質量的20%，且模型組與空白對照組體質量相比，差異有統計學意義（P＜0.01），肥胖模型建立成功。

將造模成功的大鼠按體質量分為模型組、低劑量處理組、中劑量處理組和高劑量處理組，各組體質量無統計學差異（F＝0.143，P＞0.05）。實驗結束時，低、中、高劑量處理組的體質量與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量處理組、模型組體質量與空白對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），中、高劑量處理組體質量與空白對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），表明云南小粒咖啡類黑精有控制肥胖大鼠體質量的作用。研究發現類黑精具有類膳食纖維功能，其發揮減肥作用可能因為類黑精在腸道中不被消化吸收，能夠促進腸蠕動，縮短食物在腸道中的駐留時間，發揮類膳食纖維功能[34]。云南小粒咖啡類黑精發揮減肥功能的機制應該與此相似。

2.2.2 云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠Lee’s指數、體脂質量及脂體比的影響

表2 云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠Lee’s指數、體脂質量及脂體比的影響Table2 Effect of total melanoidins on Lee’s index, body fat content and body fat ratio of SD rats

由表2可知，模型組與空白對照組Lee’s指數、體脂質量和脂體比之間均有統計學差異（P＜0.05）。空白對照組、低、中、高劑量處理組Lee’s指數與模型組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

在體脂質量方面，模型組、低、中劑量處理組與空白對照組相比，有統計學差異（P＜0.05），高劑量處理組與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），低、中劑量處理組與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），但體脂質量有下降的趨勢。

在脂體比方面，模型組、低、中劑量處理組與空白對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。高劑量處理組與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，云南小粒咖啡類黑精能減少體脂含量，可推測云南小粒咖啡類黑精能促進脂肪代謝，減少脂肪堆積。

2.2.3 云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠血脂水平的影響

由表3可知，各組間TC、TG、LDL-C濃度差異沒有統計學意義（P＞0.05），但高劑量處理組的TC、TG濃度均比模型組低。高劑量處理組的HDL-C水平比模型組水平高，且差異有統計學意義（P＜0.05），表明高劑量處理組云南小粒咖啡類黑精具有提升大鼠血清HDL-C水平的作用。

表3 中烘焙度的云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠血脂水平的影響Table3 Effect of total melanoidins on blood lipid levels of SD rats mmol/L

2.2.4 云南小粒咖啡類黑精對SD大鼠組織形態的影響

圖1 SD大鼠脂肪組織形態圖（100×）Fig.1 Morphology of adipose tissue in SD rats （100 ×）

從脂肪組織切片圖可見，模型組大鼠脂肪細胞膨大，細胞中脂肪充盈，單位視野細胞數目較少，細胞間質被脂肪擠壓變薄（圖4B）。受試物低（圖4C）、中（圖4D）、高（圖4E）劑量處理組大鼠脂肪細胞均有所減小，且排列均勻、結構完整，細胞間隙小動脈清晰可見，與空白對照組（圖4A）的相似，3 個劑量處理組相比，高劑量處理組大鼠脂肪細胞較小，形態與空白對照組的更接近，表明云南小粒咖啡類黑精能抑制脂肪細胞的膨大，減少脂肪的堆積，且高劑量處理組的效果最明顯。

圖5 SD大鼠肝臟組織形態圖（40×）Fig.5 Liver histomorphology in SD rats （40 ×）

從肝臟組織切片圖可以見，空白對照組的肝小葉結構清晰，中央靜脈清楚，肝細胞索呈放射狀排列，肝竇正常、肝細胞大小一致、細胞核清晰、胞漿均勻（圖5A）；而模型組的肝細胞正常組織結構消失，肝竇縮小甚至消失，細胞邊界模糊，肝索排列雜亂，較大面積肝細胞出現腫脹，部分胞漿呈空泡樣（圖5B）；其余各實驗組，細胞邊界較明顯，空泡面積較少，低劑量處理組（圖5C）與空白對照組相比肝索排列雜亂，肝細胞面積大小相似；中劑量處理組（圖5D）和高劑量處理組（圖5E）的形態與空白對照組的相似。表明云南小粒咖啡類黑精對實驗大鼠肝臟有較好的保護作用，中劑量處理組和高劑量處理組均有不錯的效果。有研究表明類黑精中的多酚和綠原酸等物質，能夠調節胰島素敏感性和其他代謝在肝上的轉錄水平，通過誘導脂肪酸的分解代謝，來防止脂肪沉積和肝臟損傷[35-36]。Cho等[37]報道，類黑精中的綠原酸能夠增強脂肪酸β-氧化活性促進脂肪分解。云南小粒咖啡類黑精中也存在促進脂肪酸代謝和保護肝損傷的物質，與Vitaglione等[32]的研究結果一致。

3 結 論

云南小粒咖啡類黑精及不同分子質量產物均有一定清除DPPH自由基和羥自由基的能力。在相同質量濃度下，對DPPH自由基的清除能力由高到低依次為：M總＞M3＞M2＞M1，對羥自由基的清除能力由高到低依次為：M總＞M3＞M2＞M1。采用鐵氰化鉀測定類黑精及不同分子質量產物的總還原力，結果表明，M總、M1、M2、M3均具備良好的抗氧化活性，總還原力由高到低依次為：M3＞M2＞M總＞M1。

肥胖模型建立成功后，對肥胖大鼠給予受試樣品，結果顯示：1）云南小粒咖啡類黑精具有一定的減肥作用，能抑制大鼠體質量的增加及減少肥胖大鼠體脂含量；2）高劑量處理組云南小粒咖啡類黑精能夠提高大鼠HDL-C水平，對HDL-C有較好的保護作用；3）中劑量處理組和高劑量處理組云南小粒咖啡類黑精對實驗大鼠的肝臟有較好的保護作用，能促進脂肪代謝，能較好地改善肝內脂肪堆積的癥狀。