薔薇紅景天低聚原花青素對動脈粥樣硬化大鼠肝臟的保護作用

韓 雪，周 茜，牛佳卉，吳夢穎，王亞旭，袁 靜，趙 文*

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種非常復雜的慢性疾病[1]，表現為脂質的積累、動脈血管壁的增厚以及某些炎性細胞因子的增多[2]，也是心血管疾病發病率和死亡率增加的重要因素[3]。造成AS的發病原因非常復雜，其中血脂異常導致過多的脂質在血管內壁沉積[4]、體內氧化應激造成的損傷和誘發的一些炎癥反應為主要因素[5]。肝臟是脂質代謝的重要器官，長期攝入高脂飲食會對肝臟造成一定的負擔，進而導致肝臟脂質代謝紊亂、肝臟脂肪沉積和病變[6]。近年來，隨著我國國民生活水平的提高及飲食習慣的改變，AS的患病率越來越高，并成為中國人群的主要死亡原因[7]。AS主要是膽固醇、膽固醇酯在動脈血管內、中膜大量沉積所形成的病理改變，其危險因素包括血脂異常、血糖異常、肥胖等[8]。肝臟是脂肪消化、吸收、分解、合成及運輸等過程的重要場所[9]。研究結果顯示，肝細胞脂肪病變及其伴隨的肝臟壞死性炎癥均對AS有促進作用[10]。因此研究AS發病過程中肝臟的生理狀態對于預防和治療AS具有指導意義。

原花青素是一類廣泛存在于植物中的天然多酚類化合物，是以黃烷-3-醇及其衍生物為結構單元，通過C—C鍵聚合而形成的聚合物。原花青素對心血管系統具有保護作用，尤其是在脂質代謝中通過調整氧化低密度脂蛋白而起到抗氧化作用[11]。根據聚合度可將原花青素分為高聚原花青素和低聚原花青素，其中低聚原花青素更容易被吸收。研究表明，低聚原花青素具有抗氧化、抗炎癥、緩解機體氧化應激和脂質過氧化反應，對退行性疾病具有預防作用[12]。

薔薇紅景天（Rhodiola rosea L.）為景天科（Crassulaceae）、紅景天屬（Rosales），主要生長在我國高海拔地區。研究表明，薔薇紅景天作為一種珍貴的藥用資源，主要生物活性物質有紅景天苷、酪醇和原花青素等。具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗缺氧、保護神經細胞和增強記憶力的功效，對神經系統和心臟具有保護作用。然而，目前國內外對紅景天的研究主要集中在其化學成分的分析，特別是紅景天苷及其制備方法和抗炎抗氧化等活性的研究，而對紅景天中原花青素的研究相對較少，更少有對紅景天原花青素干預AS的研究。

課題組前期對薔薇紅景天低聚原花青素（oligomeric procyanidins from Rhodiola rosea L.，OPCRR）進行了提取、純化，并對OPCRR的穩定性[13]、抗氧化和抗衰老等活性[14]進行了研究，結果顯示OPCRR具有較強的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，從而能夠增強抗衰老活性。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種天然酸性酚類物質。研究表明，姜黃素具有降低高脂血癥、抗內皮功能失調、抗氧化等作用，可在多個環節上影響AS的發生和發展[15]，因此本實驗中將其設置為陽性對照組。

本實驗采用VD3輔助脂肪乳劑灌胃的方法建立大鼠AS模型，通過對大鼠肝臟病理切片的觀察以及肝臟中脂質代謝、氧化應激和相關炎癥細胞因子等指標的測定，初步確定OPCRR對AS模型大鼠肝臟的保護作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠66 只，8 周齡，體質量160～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0004。

OPCRR為河北農業大學食品營養安全研究室制備，參考實驗室制備專利[16]的方法進行提取、純化。

VD3、丙基硫氧嘧啶、去氧膽酸鈉、膽固醇 北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測試盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測試盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）測試盒、極低密度脂蛋白膽固醇（very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-c）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、蛋白定量（考馬斯亮藍法）試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細胞介素（interleukin，IL）-1β酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）ELISA試劑盒、細胞間黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1500-823酶標儀、Finesse石蠟切片機 美國Thermo Scientific公司；SCIENTZ-IID細胞破碎儀、SCIENTZ-48組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；FA2204B電子天平 上海精密科學儀器有限公司；DH-250電熱恒溫培養箱 上海勝啟儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠AS模型的建立與劑量設計

大鼠飼養1 周后開始正式實驗。隨機分為6 組，即陰性對照組、模型對照組及OPCRR低（60 mg/kg mb）、中（120 mg/kg mb）、高（240 mg/kg mb）劑量組和姜黃素（50 mg/kg mb）對照組（陽性對照組），每組11 只。模型對照組、OPCRR3 個劑量組和姜黃素對照組用VD3輔助高脂乳劑灌胃法造模，即實驗開始前連續3 d灌胃VD340萬 IU/（kg·d），之后每天灌胃高脂乳劑，陰性對照組以蒸餾水代替，連續8 周。在造模的同時，相應組動物每天灌胃3 個劑量的OPCRR和姜黃素，陰性對照組和模型對照組灌胃蒸餾水。

1.3.2 大鼠血清制備及血脂指標測定

第56天，各組大鼠禁食12 h后，稱質量、麻醉、股動脈取血，3 000 r/min離心，取血清，檢測大鼠血清中TC、TG、LDL-c和HDL-c水平，并按照如下公式計算AS指數（atherosclerosis index，AI）。

式中：cTC為測定的血清中TC的濃度/（mmol/mL）；cHDL-c為測定的血清中HDL-C的濃度/（mmol/mL）。

1.3.3 大鼠動脈及肝臟組織生化指標測定

取大鼠肝臟，稱質量。部分肝臟按照1∶9（m/V）加入生理鹽水，利用細胞破碎儀制成質量分數10%的肝臟勻漿，酶標儀檢測大鼠肝組織中脂質、氧化應激和相關炎癥因子等指標水平。取大鼠動脈，將動脈與剩余肝臟組織樣品在體積分數10%福爾馬林溶液中充分固定后，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.4 數據統計分析

實驗數據運用SPSS 13.0進行統計分析。首先進行正態性檢驗，若數據符合正態分布，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。本實驗中所有數據均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 建立大鼠AS模型

表1 大鼠AS造模后血脂指標的變化（n＝11）Table1 Changes in blood lipid levels in rats after atherosclerosis induction （n= 11）

由表1可知，與陰性對照組相比，模型對照組的大鼠TC、TG、LDL-c水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-c水平極顯著降低（P＜0.01），AI極顯著升高（P＜0.01）且大于4，說明造模成功。

圖1 大鼠AS造模后動脈組織病理學變化Fig.1 Histopathological change in artery of AS rats

由圖1中HE染色切片可知，陰性對照組大鼠動脈壁的各層結構均正常，細胞排列整齊，層次清晰且內膜光滑，中膜平滑肌層無萎縮；模型對照組各層結構排列紊亂，與陰性對照組相比有較多的脂質沉積，內膜細胞排列疏松，內膜增厚，說明AS造模成功。

2.2 OPCRR對AS大鼠肝臟組織形態學的影響

圖2 AS大鼠肝臟組織病理學變化Fig.2 Histopathological changes in liver of AS rats

如圖2所示，陰性對照組大鼠肝臟組織形態結構清晰且完整，肝小葉和肝竇正常，肝細胞排列整齊，以中央靜脈為軸心呈輻射狀排列，肝細胞形態正常，細胞核類似圓形，位于細胞中央（圖2A1、A2）；模型對照組大鼠肝細胞出現腫脹，細胞核被擠到邊緣，肝小葉結構紊亂，肝索排列紊亂，肝竇縮小甚至消失（圖2B1、B2）；OPCRR低劑量組大鼠的肝臟組織情況與模型對照組情況基本相似（圖2C1、C2）。OPCRR中、高劑量組和姜黃素對照組大鼠的肝組織情況均有所好轉，肝細胞排列較為清晰，肝小葉結構較為正常，匯管區有少量炎細胞浸潤（圖2D～F）。

2.3 OPCRR對AS大鼠肝臟脂質的影響

由表2可知，與陰性對照組相比，模型對照組大鼠肝臟中TC、TG、LDL-c和VLDL-c的含量均極顯著上升（P＜0.01），HDL-c的含量極顯著降低（P＜0.01），即AS造模成功。與模型對照組相比，OPCRR組和姜黃素對照組各項血脂指標顯著改善，OPCRR組和姜黃素對照組的TC、LDL-c和VLDL-c的含量極顯著降低（P＜0.01），TG的含量顯著降低（P＜0.05），HDL-c的含量顯著升高（P＜0.05），說明OPCRR對AS大鼠肝臟的脂質代謝調節具有顯著改善作用，且與姜黃素效果相似。

表2 OPCRR對AS大鼠肝臟中脂質指標的影響（n＝11）Table2 Effect of OPCRR on lipid parameters in liver of AS rats （n = 11）mmol/mg

2.4 OPCRR對AS大鼠肝臟氧化應激指標水平的影響

表3 OPCRR對AS大鼠肝臟氧化應激指標水平的影響（n＝11）Table3 Effect of OPCRR on antioxidant parameters levels in liver of AS rats （n= 11）

由表3可知，與陰性對照組相比，模型對照組大鼠肝臟中的SOD和GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01），MDA的含量顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組相比，OPCRR劑量組與姜黃素對照組均有改善的趨勢，其中OPCRR各劑量組顯著提高了肝臟中SOD活力（P＜0.05，P＜0.01），姜黃素對照組顯著提高SOD活力（P＜0.05）；在提高肝臟中GSH-Px的活力方面，低劑量的OPCRR可以顯著提高GSH-Px的活力（P＜0.05），中、高劑量的OPCRR和姜黃素可以極顯著提高GSH-Px的活力，說明OPCRR提高GSH-Px的效果基本與姜黃素相似；OPCRR顯著降低了大鼠肝臟中MDA的含量（P＜0.05），而姜黃素對照組相對于模型對照組存在降低的趨勢，但基本上無顯著性差異，即OPCRR降低肝臟中MDA含量的效果要優于姜黃素。

2.5 OPCRR對AS大鼠肝臟相關炎癥細胞因子水平的影響

由表4可知，與陰性對照組相比，模型對照組所有炎性細胞因子的水平均極顯著提高（P＜0.01）。與模型對照組相比，OPCRR組和姜黃素對照組均有降低各炎癥細胞因子水平的趨勢，其中低劑量OPCRR可顯著降低肝臟中IL-1β的水平（P＜0.05），中、高劑量的OPCRR可極顯著降低肝臟中IL-1β的水平（P＜0.01），而姜黃素則對其沒有明顯影響；OPCRR各劑量和姜黃素均可極顯著降低IL-6的水平（P＜0.01）；低、中劑量的OPCRR和姜黃素均可以顯著降低IL-10的水平（P＜0.05），高劑量的OPCRR可極顯著降低IL-10的水平（P＜0.01）；低劑量的OPCRR對MCP-1和ICAM-1水平無顯著性影響，中、高劑量的OPCRR可顯著降低MCP-1和ICAM-1的水平（P＜0.05，P＜0.01）；低劑量OPCRR和姜黃素均可以顯著降低肝臟中TNF-α質量濃度（P＜0.05），中、高劑量OPCRR可以極顯著降低肝臟中TNF-α質量濃度（P＜0.01），說明在降低炎癥因子水平方面，OPCRR整體水平要優于姜黃素。

表1 OPCRR對AS大鼠肝臟中炎癥細胞因子水平的影響（n＝11）Table1 Effect of OPCRR on in fl ammatory cytokine levels in liver of AS rats （n= 11）pg/mL

3 討 論

AS已經成為嚴重影響人類生命安全的慢性疾病之一，因此成功建立動物AS模型對于研究其預防和治療效果具有十分重要的意義。研究表明AS主要表現為動脈壁鈣化和動脈壁上的脂質沉積[17]，高脂乳劑主要成分為膽固醇、丙基硫氧嘧啶、去氧膽酸鈉、豬油等，可以升高動物體內TC和TG含量，破壞甲狀腺功能，促進膽固醇的吸收，進而誘發高脂血癥；而VD3作為一種鈣離子誘導劑[18]，可使血鈣升高，誘發高鈣血癥[19]，兩者協同使動脈管壁的完整受到破壞，引起動脈內皮通透性升高，脂蛋白及單核細胞浸潤內膜，進而堆積成AS斑塊[20]。本實驗通過連續3 d灌胃VD340萬 IU/（kg·d），輔助高脂乳劑（豬油20%（質量分數，下同）、丙二醇20%、吐溫-80 20%、膽固醇10%、去氧膽酸鈉2%、丙硫氧嘧啶1%）灌胃，經過8 周，成功獲得了大鼠AS模型，為研究的開展提供了前提條件。

原花青素除具有顯著的抗氧化作用外，還具有抑制LDL形成、改善脂質代謝紊亂的作用，這可能就是原花青素對血管具有保護作用的原因。許多研究表明，高脂血癥是誘發AS的一個必要條件，有研究者認為，體內的TC、TG水平升高后，與LDL或VLDL結合成LDL-c或VLDL-c被運送到動脈管壁[21]，脂蛋白會堆積在動脈血管壁，AS過程即開始啟動，隨后經過慢性炎癥反應，AS過程加速發展[22]；因此，改善脂質代謝水平，是緩解AS的一個關鍵途徑。姜巖等[23]研究了葡萄籽原花青素對冠狀AS的防御作用，結果表明葡萄籽原花青素可以降低Wistar雄性大鼠的TC、TG和LDL-c的水平，同時提高HDL-c的水平，從脂質代謝途徑調控AS；Zhang Kexia等[24]用柿蒂類黃酮化合物對AS大鼠進行干預，結果顯示大鼠體內TC、TG、LDL-c和HDL-c指標水平均有所改善，并具有增加載脂蛋白A1表達量和降低血清載脂蛋白B的作用，且主動脈切片結果證明柿類黃酮化合物確實對AS有保護作用。本實驗以OPCRR為研究對象，干預AS Wistar雄性大鼠肝臟中的脂質代謝，最終結果與上述文獻具有相同的趨勢，說明OPCRR具有通過調節脂質代謝而緩解AS的效果。

肝臟在脂質代謝的過程中起著重要的作用，其主要功能是合成脂蛋白和促進脂質運輸。發生AS時，往往伴隨著脂肪肝等肝臟疾病的出現，原因是膽固醇排泄的主要途徑是膽汁酸的排泄，過度攝入的脂肪會導致肝臟不能正常代謝甚至肝損傷，脂肪會堆積在肝臟，影響肝細胞的功能、造成結締組織增生，最終導致肝硬化。AS通常會導致體內脂質代謝紊亂，甚至會導致脂肪肝。李向陽等[25]研究了金釵石斛多糖對高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響，證明了高脂血癥可以引發肝臟脂肪變性，且通過切片證實，金釵石斛多糖可以從肝小葉結構、肝細胞形態、變性程度等多方面對肝臟進行保護；李國娟等[26]研究也證明了過氧化物酶增值物激活受體γ激活蛋白1-α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α，PGC-1α）增加可以促進膽固醇的分解和膽汁的分泌，調節血脂代謝，所以增加AS大鼠肝臟中PGC-1α的表達可以保護心血管，抑制AS的形成。本研究的HE染色結果表明，OPCRR可以改善AS大鼠的肝細胞形態，保護肝臟結構，減少肝組織中的炎性灶，緩解肝損傷和變性的發生。

自由基引發脂質過氧化是AS形成的重要原因之一。盛沖霄等[27]發現，氧化應激是誘發頸部AS的一個重要原因，其中活性氧積聚，與血管舒張因子NO之間的平衡被打破，引起內皮功能障礙，是AS開始形成的關鍵。近年來，實驗證明，多種炎癥細胞因子的過度釋放也是導致AS的一個關鍵原因[28]，血液中的LDL-c是一種炎性誘導劑，可誘導黏附因子（ICAM-1和VCAM-1）增加聚集到AS早期病變區形成AS[29]；另一種在AS的發展階段中起關鍵性作用的炎癥細胞因子是MCP-1，它主要是吸引其他多種炎癥細胞黏附到AS病變區域，促進AS的形成[30]；此外參與AS過程的還有IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等促炎性因子。何忠梅等[31]利用短梗五加果多酚減少了多種炎性細胞因子的表達，并緩解了SD大鼠AS的情況，與本實驗證明的OPCRR可以顯著降低Wistar大鼠肝臟中各炎癥因子水平的結果相似。

4 結 論

本實驗以OPCRR為研究對象，采用VD3聯合高脂乳劑方法可成功建立大鼠AS模型，研究了其對AS大鼠肝臟的保護作用及作用機制。結果顯示，OPCRR可以通過改善脂質代謝、提高抗氧化能力和抑制細胞炎癥因子來干預AS大鼠脂肪肝的形成，明顯改善大鼠肝臟結構形態，緩解由AS造模過程產生的肝損傷。而關于OPCRR是如何通過調節相關信號通路來抑制AS的形成需進一步進行研究。