基于蓄冷劑模擬貯運的秀珍菇細胞膜損傷和酶活力變化

王 蕾，俞凌峰，李君豪，嚴嘉瑋，羅自生，李 莉*

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

隨著社會經濟增長，消費者對于果蔬的品質有了更高的要求。低溫環境對采后貯藏和運輸過程中果蔬品質特征維持具有重要作用[1-3]，目前我國果蔬低溫貯運多采用冷鏈運輸方式，費用相對較高。作為冷源，蓄冷劑利用相變蓄冷原理控制低溫，可根據冷鏈運輸的不同溫度需求將不同蓄冷材料進行合理配置，達到食品冷鏈物流的要求，且因其低廉的成本和簡易的操作，在食品低溫貯藏、低溫運輸、低溫加工、低溫銷售等食品冷鏈的各環節中都具有廣泛的應用背景和巨大的節能潛力。目前，蓄冷劑在萵筍尖[4]、平菇[5]、韭黃[6]等多種蔬菜中的保鮮效果已有研究。

秀珍菇（Pleurotus geesteranus），又稱姬平菇、小平菇等，隸屬于擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬[7]，富含蛋白質、維生素和微量元素等且脂肪含量較低[8]，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節活性等生理活性功能[9-10]，深受消費者青睞。但其組織細嫩、沒有外衣保護且存在自身自溶作用，嚴重影響了其食用品質和商品價值，是限制貯運保鮮的關鍵因素之一[11]。目前針對食用菌的保鮮技術研究主要包括低溫保鮮[12-14]、保鮮劑保鮮[12]和氣調保鮮[15-17]等。其中低溫保鮮主要集中于研究不同貯藏溫度對秀珍菇采后品質的影響，而有關蓄冷劑對秀珍菇貯藏運輸中的作用研究較少。

本研究采用本實驗室前期研發的蓄冷劑，對秀珍菇的冷藏效果進行了模擬貯藏和模擬運輸實驗。以常溫貯藏為空白組，根據蓄冷劑與秀珍菇質量比分為1∶4組、1∶2組以及1∶1組，模擬貯藏即將秀珍菇置于常溫（24±2）℃下貯藏，模擬運輸即置于汽車的后備箱，每日行駛約120 km，氣溫在2～25 ℃范圍內波動。每日測定秀珍菇細胞膜透性及酶活力等相關生理指標，從而研究蓄冷劑在模擬貯藏和模擬運輸過程中對秀珍菇品質的影響，為進一步開發蓄冷劑在食用菌的冷鏈運輸作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）產自嘉興市平湖市，采收于2017年12月至2018年2月，采收菌蓋直徑達3～4 cm、菌蓋邊緣內卷的秀珍菇，采收后2 h內運回實驗室進行下一步處理。秀珍菇的模擬貯運實驗每組用量為4 kg，生物性重復3 次。

蓄冷劑為本實驗室前期所研制，主要配方為：甘氨酸0.4～0.8 mol/L、丙三醇0.1 mol/L、苯甲酸鈉質量分數0.1%、高吸水樹脂質量分數0.75%～0.81%。其相變潛熱為296.4～305.9 J/g，Onset溫度為－7.3～－5 ℃。

過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16M型離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-5800PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；CR-400型色差儀 柯尼卡美能達（中國）投資有限公司；MULTISKAN MK3型酶標儀 上海賽默飛世爾儀器有限公司；RC-4迷你型溫度記錄儀 江蘇精創電器股份有限公司；LEICA EM UC7型超薄切片機北京海德創業生物科技有限公司；H-7650型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 保溫箱的制備及蓄冷劑的安置

在外徑為500 mm×350 mm×320 mm、內徑為450×300×270 mm的泡沫箱內的四壁中加入4 塊已裁剪好且尺寸合適的4 個泡沫板（兩塊400 mm×240 mm×25 mm、兩塊300 mm×240 mm×25 mm），留出一定的高度，放置一塊面積略小于泡沫箱底板面積的塑料孔板，然后將凍好的蓄冷板放在孔板上，其目的是較好地安置蓄冷劑，且可避免蓄冷劑與秀珍菇的直接接觸，效果如圖1所示。

圖1 蓄冷劑安置的效果圖（A）和實體圖（B）Fig.1 Schematic （A） and photograph （B） of coolant installation in foam box

1.3.2 秀珍菇的模擬貯藏與運輸方式

將秀珍菇隨機分為4 組，根據蓄冷劑與秀珍菇質量比分別為CT（對照）組、1∶4組、1∶2組以及1∶1組，每組放置4 kg秀珍菇，孔板上分別安置0、1、2、4 kg的蓄冷劑。根據模擬貯運方式分2 批進行實驗，分別為秀珍菇模擬貯藏和秀珍菇模擬運輸。模擬貯藏實驗中將包含秀珍菇和蓄冷劑的保溫箱置于常溫（（24±2）℃）下貯藏。模擬運輸實驗中將保溫箱置于汽車的后備箱，以40 km/h每日行駛約120 km，外界氣溫在2～25 ℃范圍內波動。實驗過程中，采用RC-4迷你型溫度記錄儀實時監測箱體內溫度。每種實驗進行3 次生物性重復。1.3.3 秀珍菇保鮮品質指標的測定

1.3.3.1 外在表征及物理性質的測定

每批實驗中每個處理隨機稱取秀珍菇樣品100 g左右，每日進行拍照和稱質量。使用差重法計算秀珍菇樣品的質量損失率[18]，每組樣品共重復測定15 次。用色差儀測定秀珍菇傘蓋中部色度[19]，記錄L*、a*、b*值，盡量避開明顯的機械損傷，每組樣品共重復測定15 次。

1.3.3.2 細胞膜透性相關指標的測定

參考曹建康等[20]的方法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、細胞膜透性和H2O2含量。

1.3.3.3 TEM觀察

TEM觀察參考徐柏森等[21]的方法，并略作修改。取秀珍菇傘蓋中部上表皮為樣品，浸入體積分數2.5%的戊二醛中，固定2 h以上。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min，用體積分數1%的鋨酸溶液固定樣品2 h，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min，乙醇梯度脫水，純丙酮脫水2 次，Spurr包埋劑梯度滲透，70 ℃加熱過夜。包埋塊在超薄切片機中切片，獲得70～90 nm的切片，切片經檸檬酸鉛溶液、醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min后觀察。

1.3.3.4 SOD、CAT活力的測定

SOD、CAT活力的測定分別參考SOD試劑盒和CAT試劑盒說明書。

1.4 數據統計與分析

實驗中指標的每個測量點都來自3 個生物性重復和至少3 個技術性重復，采用Excel軟件進行數據統計和分析，采用Origin 8.0軟件作圖，采用DPS 7.05軟件對所有數據在0.05水平上使用Duncan法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中溫度的影響

溫度是維持食用菌品質的最重要因素之一[22]。如圖2A所示，在模擬貯藏實驗前1 800 min，與對照組相比，蓄冷劑貯藏組溫度明顯更低。隨貯藏時間延長，蓄冷劑貯藏組溫度逐漸上升，而后趨于穩定，以其溫度達對照組溫度時記為失效。其中，1∶4組的蓄冷劑在1 875 min（1.3 d）失效，1∶2和1∶1組的蓄冷劑分別在2 618（1.8 d）、2 989 min（2.1 d）失效。如圖2B所示，在模擬運輸實驗中，由于實驗時間在冬季，保溫箱放置于室外車輛后備箱中，運輸溫度隨每日氣溫變化在2～25 ℃范圍內有較大波動，隨貯藏時間延長，蓄冷劑逐漸失效，貯藏后期蓄冷劑組箱內溫度變化趨勢與CT組相同。其中，1∶4組的蓄冷劑在1 785 min（1.2 d）左右失效，1∶2組和1∶1組的蓄冷劑在4 665（3.2 d）、4 890 min（3.4 d）左右失效。由此可知，蓄冷劑保持低溫的效果隨蓄冷劑用量增加而增強。

圖2 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中箱內溫度變化Fig.2 Change in temperature inside foam box during simulated storage （A） and transportation （B）

2.2 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中外觀特性的影響

圖3 秀珍菇模擬貯藏過程中表觀照片Fig.3 Photographs of Pleurotus geesteranus during simulated storage

如圖3所示，模擬貯藏實驗中，第0天秀珍菇組織細嫩，菌蓋和菌柄顏色相對較亮；貯藏4 d后的CT組以及第5天的1∶4、1∶2組菌蓋顏色變暗，且菌柄出現褐變，失水嚴重，秀珍菇皺縮，感官品質較差；第5天的1∶1組則在各方面相對較好。說明蓄冷劑有效地延緩了秀珍菇的自溶，且其效果在一定范圍內隨用量增加而增加。

圖4 秀珍菇模擬運輸過程中表觀照片Fig.4 Photographs of Pleurotus geesteranus during simulated transportation

如圖4所示，模擬運輸實驗中，各組在前4 d保持了較好的外觀品質，第6天對照組秀珍菇菌柄顯示出一定程度的褐變。蓄冷劑用量越大，秀珍菇表觀特征越好，1∶1組在實驗后期呈現最佳外觀品質，這與模擬貯藏組結果相同。此外，運輸過程使秀珍菇出現更多的機械損傷，導致其脆嫩的傘蓋裂開甚至缺失。

2.3 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中質量損失率的影響

圖5 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中質量損失率變化Fig.5 Changes in mass loss during simulated storage （A） and transportation （B）

由于蒸騰作用，秀珍菇在采后水分會不斷蒸發，造成秀珍菇質量減輕、鮮度下降，還使秀珍菇的代謝紊亂，呼吸作用受到影響，加劇酶促褐變，最終嚴重影響商品價值和貨架期[23]。如圖5A所示，模擬貯藏實驗中，秀珍菇質量損失率隨貯藏時間延長而增加，這與之前學者研究結果[24]相同。第4天時秀珍菇的質量損失率從大到小的組別分別是1∶2組、1∶4組、CT組、1∶1組，這與張艷君等[23]的實驗結果趨勢不同。本實驗不能證明蓄冷劑對秀珍菇保鮮的正向作用，可能是秀珍菇因其傘蓋脆嫩易分離，質量損失率數據有一定偏差造成的結果。

如圖5B所示，模擬運輸實驗中，在第2天CT組和1∶1組質量損失率較高，而后1∶1組質量損失率維持相對穩定，其他組保持上升。第6天時，CT組和1∶2組質量損失率較高，1∶4組與1∶1組具有良好保持水分效果。第2天1∶1組質量損失率高可能是由于機械損傷造成菌蓋缺失，脆嫩的菌蓋是造成測量誤差的最大因素，但通過該數據仍能得出蓄冷劑在模擬運輸過程中有助于延緩秀珍菇質量損失、維持自身品質這一結論。

2.4 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中色澤的影響

圖6 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中色澤變化Fig.6 Changes in color during simulated storage （A） and transportation （B）

食用菌的色澤與其生理狀態密切相關，是評判食用菌品質變化的一個重要指標，能在一定程度上反映其褐變程度[25]。如圖6A1～A3所示，模擬貯藏實驗中，秀珍菇L*值和a*值無明顯變化，但與0 d相比，CT組b*值在第2天顯著上升，且顯著高于實驗組（P＜0.05）。b*值升高說明試樣由藍變黃，表明在這一貯藏期間，CT組先發生褐變，說明蓄冷劑營造的低溫環境能延緩秀珍菇的褐變現象。張艷君等[23]通過實驗得出秀珍菇貯藏溫度越高，褐變程度越嚴重，但其L*值在前6 d也無顯著性差異，與本實驗結果基本相同。

如圖6B1～B3所示，模擬運輸實驗中，秀珍菇L*值和a*值隨運輸時間的延長無明顯變化，b*值在運輸的4～6 d顯著上升（P＜0.05）。但在運輸的第6天CT組、1∶4組、1∶2組之間無顯著差異，無法體現蓄冷劑的保鮮效果，可能是因為秀珍菇色澤總體變化較小，秀珍菇傘蓋顏色本身較深，較難觀測到傘蓋上的褐變。

2.5 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中MDA含量的影響

MDA是由脂質中不飽和脂肪酸發生膜脂過氧化作用而產生的，它的產生和積累會對果蔬和食用菌的生物膜造成嚴重損傷，引起衰老[26-27]。MDA含量增加是過氧化作用加劇、膜受到損傷的重要表現，其含量越高表明膜脂過氧化作用越強，酶和膜系統受到的損傷越嚴重。如圖7A所示，模擬貯藏實驗中，在第0天秀珍菇MDA含量低，CT組的MDA含量在0～2 d顯著升高，但其余實驗組在2～4 d時才開始顯著升高（P＜0.05）。蓄冷劑的使用使得貯藏溫度降低，MDA積累減緩，這與雙孢蘑菇[28]和羅漢果[29]在低溫貯藏的實驗結果相似，說明蓄冷劑的存在抑制了秀珍菇膜脂過氧化。然而在貯藏的第5天，1∶1組MDA含量顯著高于其他組（P＜0.05），說明蓄冷劑過量也會對秀珍菇造成膜損傷。

如圖7B所示，模擬運輸實驗中，CT組秀珍菇MDA含量在0～2 d顯著上升（P＜0.05）。1∶4組和1∶2組在第6天時MDA含量才顯著高于第0天（P＜0.05）。而1∶1組在貯藏過程中未發生顯著改變。說明蓄冷劑有效抑制了運輸過程中秀珍菇脂質氧化，且蓄冷劑與秀珍菇質量比在1∶4～1∶1范圍內，蓄冷劑比例越大，抑制脂質氧化效果越好。

圖7 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中MDA含量變化Fig.7 Evolution of MDA content during simulated storage （A） and transportation （B）

2.6 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中H2O2含量的影響

圖8 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中H2O2含量變化Fig.8 Evolution of H2O2 content during simulated storage （A） and transportation （B）

食用菌體內積累的H2O2可以直接或間接地導致細胞膜脂質過氧化，加速細胞的自溶和衰老；因此H2O2含量能夠反映食用菌細胞膜脂質過氧化損害的程度。如圖8A所示，模擬貯藏實驗中，與0 d相比，秀珍菇的H2O2含量在第2天顯著上升，其中1∶1組上升最多，而1∶4組H2O2含量相比其他組較低，說明一定比例的蓄冷劑能夠抑制H2O2的產生，但過量的蓄冷劑會導致H2O2含量升高。

如圖8B所示，模擬運輸實驗中，所有組秀珍菇的H2O2含量在2～4 d都顯著上升，CT組在4～6 d繼續顯著上升，第6天時，實驗組H2O2含量顯著低于CT組（P＜0.05）。這與趙天鵬[30]的研究結果相似，即食用菌所在環境溫度越高，其H2O2含量越高，說明蓄冷劑能有效抑制秀珍菇機體內H2O2的產生。但是，與模擬貯藏實驗類似，在所有實驗組中1∶4組H2O2含量明顯低于其他組，說明蓄冷劑的增加可能對秀珍菇造成損傷。

2.7 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中細胞膜透性的影響

圖9 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中細胞膜透性變化Fig.9 Evolution of cell membrane permeability during simulated storage （A） and transportation （B）

在貯藏過程中，秀珍菇體內大分子的不飽和脂肪酸含量逐漸下降，導致自由基和活性氧含量增加，膜脂過氧化作用嚴重，使得其細胞膜系統的完整性受到破壞，膜滲性增強，內容物外滲，導致在貯藏后期食用菌發生嚴重的自溶現象；因此細胞膜透性能夠反映食用菌的衰老程度和健康狀態[31]。如圖9A所示，模擬貯藏實驗中，CT組秀珍菇的細胞膜透性在0～2 d范圍內顯著升高，但其余實驗組在2～4 d時細胞膜透性才開始顯著升高（P＜0.05），這與陳素芹[28]的研究結果相似，即低溫抑制細胞膜透性的增大，說明蓄冷劑的存在保護了秀珍菇細胞膜的完整性，但是1∶1組細胞膜透性差于其他實驗組，可能過多的蓄冷劑所產生的低溫反而對細胞膜結構造成損傷，進而增大細胞膜透性。

如圖9B所示，模擬運輸實驗中，CT組秀珍菇膜透性從0～2 d開始升高，1∶4組和1∶2組從第2天開始呈顯著上升趨勢，1∶1組在0～4 d無顯著變化。運輸6 d后，CT組和1∶4組細胞膜透性顯著高于1∶2組和1∶1組。說明在運輸過程中，蓄冷劑的使用能有效抑制膜脂過氧化，維持細胞膜系統的完整性，且蓄冷劑用量越大，維持細胞膜系統完整性效果越好。

2.8 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中SOD活力的影響

圖10 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中SOD活力變化Fig.10 Evolution of SOD activity during simulated storage （A） and transportation （B）

SOD在動物、植物、微生物和培養細胞中廣泛存在，能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，生成O2和H2O2。SOD在生物抗氧化系統中具有重要作用，能與CAT、過氧化物酶等協同作用來抵御活性氧及其他過氧化物自由基對細胞膜系統的傷害，從而減輕機體所受的傷害[28]，是食用菌中一種非常重要的抗氧化酶[32]。如圖10A所示，模擬貯藏實驗中，CT組秀珍菇的SOD活力在0～1 d顯著下降，并在0～3 d保持下降趨勢，3～4 d時回升。而實驗組的秀珍菇SOD活力下降緩慢，其下降幅度小于CT組，在第2天，各實驗組SOD活力顯著低于第0天（P＜0.05），2～4 d時趨于平穩，該數據與趙天鵬[30]的研究結果類似，說明蓄冷劑能夠減緩秀珍菇SOD活力下降的速度。

如圖10B所示，模擬運輸實驗中，CT組秀珍菇SOD活力在運輸過程中持續顯著下降（P＜0.05）。在第4天時，各實驗組SOD活力顯著高于CT組，在第6天時，1∶1組秀珍菇SOD活力顯著高于其他組（P＜0.05）。這說明在運輸過程中蓄冷劑也能減緩SOD活力下降的速度，且蓄冷劑與秀珍菇質量比在1∶1時效果最佳。

2.9 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中CAT活力的影響

圖11 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中CAT活力變化Fig.11 Evolution of CAT activity during simulated storage （A） and transportation （B）

CAT在動物、植物、微生物和培養細胞中廣泛存在，是最重要的H2O2清除酶，在生物抗氧化系統中具有重要作用，是防止果蔬褐變的相關酶之一[23]。如圖11A所示，在貯藏期間，秀珍菇CAT活力持續上升，這可能與秀珍菇機體內H2O2含量的持續上升有關。其中，1∶1組從第1天后才開始上升，可能是過多的蓄冷劑產生的低溫環境抑制了0～1 d的CAT活力，之后溫度慢慢回升，也使CAT活力上升。CAT活力的增長趨勢與趙天鵬[30]研究中貯藏前期的結果相似，在貯藏的第4天，各組CAT活力無顯著性差異。

如圖11B所示，模擬運輸實驗中，CT組、1∶4組和1∶2組CAT活力均呈現先顯著上升后下降的趨勢（P＜0.05），1∶1組上升較緩慢而后保持穩定，可能與其營造的低溫環境有關。運輸的第4天，1∶4組CAT活力顯著高于其他組（P＜0.05），說明一定范圍內使用蓄冷劑可以提升CAT活力，過量使用可能導致溫度降低、CAT活力受抑制。第6天時，1∶1組CAT活力顯著高于其他組（P＜0.05），這與1∶1組箱內溫度回升有關。

2.1 0 蓄冷劑處理對秀珍菇模擬貯運過程中細胞結構的影響

圖12 秀珍菇模擬貯藏（A）和模擬運輸（B）過程中秀珍菇TEM照片Fig.12 Transmission electron microscopy images of Pleurotus geesteranus during simulated storage （A） and transportation （B）

如圖12A0所示，模擬貯藏實驗中，在第0天秀珍菇（鮮樣）細胞內容物豐富，可以明顯地看到許多線粒體、液泡等，且細胞質濃厚、細胞膜形狀圓滑、整體狀態較好；如圖12A1～A4所示，到貯藏的第4天，各組內容物均變得稀疏，實驗組內容物相對豐富，且各組均出現了一些油脂滴，可觀察到細胞器結構明顯變少，CT組細胞略顯縮水，形態變得不規則，細胞核消失，細胞器數量明顯變少，細胞黏著力下降，總體說明蓄冷劑的存在有助于保持秀珍菇的細胞形態及結構完整性。

如圖12B0所示，模擬運輸實驗中，在第0天秀珍菇細胞內容物豐富。如圖12B1～B4所示，運輸的第4天，各組秀珍菇細胞中均出現了數量不等的油脂滴，說明被氧化程度高；且第4天CT組細胞內容物少，細胞核消失，細胞器數量變少，自溶程度較高；實驗組內容物多，存在完整細胞核且細胞形態圓滑，說明蓄冷劑有助于維持秀珍菇的細胞形態及結構完整性。

3 結 論

蓄冷劑能夠有效營造秀珍菇貯運過程中的低溫環境，維持秀珍菇的外觀特性、表面色澤、細胞結構完整性，減少質量損失，減緩MDA和H2O2積累，抑制SOD活力下降。這說明蓄冷劑在秀珍菇的貯藏和運輸過程中能有效地抑制自溶、延緩衰老。在模擬貯藏過程中，1∶1組在抑制MDA積累、抑制細胞膜透性增加方面差于1∶4組和1∶2組，造成該結果可能是因為過多的蓄冷劑在實驗前期釋放的大量冷量對食用菌的細胞結構造成了損傷，使得細胞膜透性增強，細胞液滲出。1∶4組和1∶2組在維持秀珍菇各方面品質上的作用差異不大，從經濟角度考慮，在秀珍菇貯藏過程中蓄冷劑和食用菌質量比為1∶4較宜。

在模擬運輸過程中，1∶1組在維持秀珍菇外觀特性、減少質量損失、抑制MDA積累、抑制細胞膜透性增加和減緩SOD活力下降等方面效果優于1∶4組和1∶2組；因此在本次秀珍菇的運輸實驗中，蓄冷劑和食用菌質量比為1∶1較宜。但是，在實際運用當中，需要考慮貯運溫度、維持時間和貯運經濟性等各方面因素，確定合理的蓄冷劑使用比例。