曲酸對(duì)冷鮮鴨肉中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑制作用及其抑菌機(jī)理

侯溫甫，歐陽(yáng)何一，吳 忌，韓千慧，周 敏，王宏勛*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430023；3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

曲酸是由青霉和曲霉真菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種有機(jī)酸，對(duì)人體無(wú)害[1]，對(duì)細(xì)菌、酵母菌及霉菌均具有較強(qiáng)的抑制作用[2-4]，蘇國(guó)成等[5]研究發(fā)現(xiàn)曲酸對(duì)食品中常見(jiàn)污染菌，尤其是對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌效果顯著，體積分?jǐn)?shù)0.1%的曲酸就可以起到根本性抑制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的良好效果；曲酸與喹諾酮類(lèi)物質(zhì)[6]、殼聚糖[7]等合成后能增強(qiáng)體外抗菌活性。此外，曲酸能夠抑制多酚氧化酶活性[8]，有效清除自由基和提高抗氧化能力[9]。與山梨酸和苯甲酸及其鹽類(lèi)等化學(xué)添加劑相比，曲酸具有能夠與水互溶、pH值變化對(duì)其抑菌力無(wú)明顯影響[10]、熱穩(wěn)定性良好、可抑制亞硝酸鹽產(chǎn)生致癌物質(zhì)[5,11]等特點(diǎn)，在果蔬、肉制品與水產(chǎn)品等護(hù)色保鮮方面有著廣闊的應(yīng)用潛力[12]。

冷鮮鴨肉因其肉質(zhì)柔軟、風(fēng)味鮮美、安全衛(wèi)生、汁液流失少且便于進(jìn)一步加工制作而受到消費(fèi)者青睞，但受限于屠宰技術(shù)、衛(wèi)生條件、加工設(shè)備現(xiàn)代化程度等因素，尤其是在加工、包裝與貯藏階段中微生物的污染嚴(yán)重影響了其商品價(jià)值，冷鮮鴨肉產(chǎn)品在我國(guó)仍處于起步階段[13-15]。冷鮮鴨肉的腐敗菌及常見(jiàn)病原微生物主要有假單胞菌屬、氣單胞菌屬、熱殺索絲菌、沙門(mén)氏菌等[16-18]，如何有效控制冷鮮鴨肉中腐敗微生物的增殖是促進(jìn)冷鮮鴨肉產(chǎn)品快速發(fā)展的重要技術(shù)瓶頸。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，曲酸能夠有效抑制冷鮮鴨肉產(chǎn)品微生物增殖，維持冷鮮鴨肉良好品質(zhì)，顯示曲酸具備作為冷鮮鴨肉安全高效保鮮劑的應(yīng)用潛力。現(xiàn)階段對(duì)曲酸抑菌特性及機(jī)理研究主要集中于對(duì)微生物數(shù)量的控制[19]，曲酸抑制冷鮮鴨肉中腐敗微生物的特性與抑菌機(jī)理尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以冷鮮鴨肉中主要腐敗微生物假單胞菌、氣單胞菌、熱殺索絲菌和具有致腐能力的常見(jiàn)病原微生物沙門(mén)氏菌為研究對(duì)象，研究曲酸對(duì)4 株菌株的抑制作用和抑菌機(jī)理，以期為曲酸在冷鮮鴨肉產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

假單胞菌、熱殺索絲菌、氣單胞菌、沙門(mén)氏菌由武漢輕工大學(xué)微生物與食品研究所提供，分離自冷鮮鴨肉；曲酸（化學(xué)純食品級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；蛋白電泳試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ca2＋、K＋、Mg2＋測(cè)試試劑盒、β-半乳糖苷酶試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；紅霉素、利福平 合肥Biosharp公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀 芬蘭Bioscreen公司；GL-20G-II型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；1645050型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；掃描電子顯微鏡 日本HITACHI公司。

1.3 方法

1.3.1 曲酸對(duì)菌株的抑制作用

1.3.1.1 曲酸對(duì)腐敗菌最小抑菌濃度的測(cè)定

曲酸對(duì)菌株的最小抑菌濃度的測(cè)定參考劉蔚等[20]的方法。適宜溫度下（沙門(mén)氏菌37 ℃、熱殺索絲菌27 ℃、假單胞菌30 ℃、氣單胞菌30 ℃，下同）活化供試菌，200 r/min液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h。添加對(duì)數(shù)期的供試菌100 μL于已滅菌的10 mL液體LB培養(yǎng)基中使菌液濃度保持在107CFU/mL，添加曲酸溶液至終質(zhì)量濃度分別為31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL，用無(wú)菌蒸餾水代替曲酸溶液作為空白對(duì)照組。于搖床中培養(yǎng)24 h后觀察，以無(wú)菌生長(zhǎng)的曲酸處理組最低質(zhì)量濃度為最小抑菌濃度。

1.3.1.2 曲酸對(duì)腐敗菌株抑菌效果的測(cè)定

將已滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿傾倒15 mL，待其凝固。取100 μL菌液滴加至凝固的培養(yǎng)基表面，用已滅菌的涂布棒涂抹均勻。在已凝固的培養(yǎng)基表面上垂直放入牛津杯，輕輕加壓（鑷子輕按即可），使其與培養(yǎng)基無(wú)空隙接觸。在牛津杯內(nèi)加入200 μL質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL曲酸溶液，勿使其外溢，以無(wú)菌水和體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液分別作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，蓋上陶瓦蓋，避免冷凝水滴下，加完樣品后在適宜溫度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～24 h，觀察結(jié)果，讀取抑菌圈直徑。

1.3.1.3 曲酸對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)曲線的影響

腐敗菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定參考何麗[21]的方法進(jìn)行。移液槍吸取0.5 mL濃度為106～107CFU/mL的菌懸液分別加入5 mL LB培養(yǎng)基中，添加曲酸溶液使曲酸終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，混勻。吸取200 μL混有接種菌與曲酸的培養(yǎng)基至蜂窩狀樣品板中，每個(gè)樣品質(zhì)量濃度測(cè)3 個(gè)平行，無(wú)菌蒸餾水作空白對(duì)照。樣品板置于全自動(dòng)分析儀檢測(cè)器中，設(shè)定適宜溫度培養(yǎng)2 d，每隔2 h自動(dòng)測(cè)定一次，收集數(shù)據(jù)并作圖。

1.3.2 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞膜作用分析

1.3.2.1 曲酸對(duì)菌株表面疏水性的影響

參考馮建嶺[22]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。無(wú)菌條件下將供試菌分別接種至100 mL LB無(wú)菌培養(yǎng)基中，于各菌適宜溫度200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。6 000 r/min冷凍離心收集菌體，沉淀溶于無(wú)菌生理鹽水后再離心取菌體沉淀，重復(fù)3 次。最終用0.1 mol/L硝酸鈉（pH 6.2）將菌體重懸至108CFU/mL，實(shí)驗(yàn)分為2 組：1）空白對(duì)照組：取3.0 mL重懸菌液，加入3 mL無(wú)菌生理鹽水；2）處理組：取3.0 mL重懸菌液，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)1%的曲酸溶液，控制曲酸最終質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL。

振蕩混勻置于各菌適宜溫度培養(yǎng)2 h，分別取5 mL菌液于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，并標(biāo)記為ODa；分別再取4.8 mL菌液與0.8 mL十六烷，用漩渦混合器混勻，室溫條件下靜置15 min，待兩相分離，并在20 min后吸取水相測(cè)定光密度值，標(biāo)記為ODb，吸附率按下式計(jì)算，每組重復(fù)3 次。吸附率越高，疏水性越強(qiáng)。

1.3.2.2 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞膜滲透性的影響

參照馮建嶺[22]、郝剛[23]等的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。將菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后分別移取5 mL菌液置于無(wú)菌試管中，平均分為4 組：1）紅霉素組：分別加入0.5 mL無(wú)菌蒸餾水，然后再分別加入0.5 mL 100 μg/mL的紅霉素溶液；2）紅霉素＋曲酸組：分別加入0.5 mL無(wú)菌曲酸溶液，使其終質(zhì)量濃度約為4.0 mg/mL，然后再加入0.5 mL 100 μg/mL的紅霉素溶液；3）利福平組：分別加入0.5 mL無(wú)菌蒸餾水，然后再分別加入0.5 mL 20 μg/mL利福平溶液；4）利福平＋曲酸組：先分別加入0.5 mL無(wú)菌曲酸溶液，使其終質(zhì)量濃度約為4.0 mg/mL，然后再分別加入0.5 mL 20 μg/mL的利福平溶液。

將上述各組試管充分搖晃混勻，置于適宜溫度恒溫培養(yǎng)10 h，在630 nm波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)檢測(cè)其光密度值的變化。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，最終結(jié)果取平均值。

1.3.2.3 掃描電子顯微鏡觀察曲酸對(duì)菌株細(xì)胞形態(tài)的影響

參考Wang Chenjie等[24]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，具體操作如下：無(wú)菌條件下將濃度為107CFU/mL的供試菌液添加到10 mL LB培養(yǎng)基中，加入曲酸至終質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL，空白對(duì)照組以無(wú)菌水代替，于適宜溫度下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。此后，4 ℃條件下6 500 r/min離心10 min去上清液，用0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液清洗3 次。采用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液（0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制）低溫固定24 h，0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次15 min。分別采用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次5 min。分別采用醋酸異戊酯-丙酮（體積比1∶1）和醋酸異戊酯各置換2 次，每次5 min。噴金處理后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.3 曲酸對(duì)菌株胞內(nèi)物質(zhì)的影響研究

1.3.3.1 曲酸對(duì)菌株呼吸鏈脫氫酶的影響

參照馮建嶺[22]的方法進(jìn)行，操作如下：取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期菌懸液1.0 mL分別于4 支無(wú)菌試管，再分別加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.6）2.0 mL、0.1 mol/L葡萄糖溶液2.0 mL及1.0 mg/mL 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（紅四氮唑）溶液2.0 mL，充分搖勻。向其中3 支試管中加入曲酸溶液，控制質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL，空白對(duì)照組用無(wú)菌水代替。將各組具塞試管置于適宜溫度培養(yǎng)6 h，然后分別滴加2 滴濃硫酸終止反應(yīng)，此時(shí)可以觀察到顏色變化，并拍照。最后，再往各管中分別加入5.0 mL正丁醇，振蕩萃取，接著靜置30 min后取上層液體于4 500 r/min離心6 min，測(cè)定上清液在490 nm波長(zhǎng)處光密度值（以正丁醇作參比）。

1.3.3.2 曲酸對(duì)菌株β-半乳糖苷酶活力的影響

無(wú)菌條件下將供試菌分別接種至100 mL LB無(wú)菌培養(yǎng)基中，適宜溫度200 r/min振蕩培養(yǎng)。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的供試菌10 mL于無(wú)菌試管中，加入曲酸溶液至終質(zhì)量濃度4.0 mg/mL，用無(wú)菌蒸餾水代替曲酸溶液作為空白對(duì)照組，適宜溫度搖床中培養(yǎng)6 h后6 500 r/min離心10 min。取上清液作為樣液，按照試劑盒操作步驟測(cè)定β-半乳糖苷酶活力。

1.3.3.3 曲酸對(duì)菌株堿性磷酸酶活力的影響

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的供試菌10 mL與無(wú)菌試管中，加入曲酸溶液至終質(zhì)量濃度4.0 mg/mL，用無(wú)菌蒸餾水代替曲酸溶液作為空白對(duì)照組。適宜溫度（同1.3.1.1節(jié)）搖床中培養(yǎng)6 h后，6 500 r/min離心10 min，取上清液作為樣液，按照試劑盒步驟進(jìn)行操作，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組光密度值。定義每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1 個(gè)金氏單位。

1.3.3.4 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞內(nèi)Ca2＋、K＋、Mg2＋泄漏的影響

無(wú)菌條件下將供試菌分別接種至液體培養(yǎng)基中，適宜溫度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。加入曲酸溶液至終質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL，用無(wú)菌蒸餾水代替曲酸溶液作為空白對(duì)照組。適宜溫度搖床中培養(yǎng)6 h后6 500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定培養(yǎng)基中Ca2＋、K＋、Mg2＋濃度。具體測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行。

1.3.3.5 曲酸對(duì)菌株菌體蛋白質(zhì)的影響

菌體蛋白質(zhì)提取參照Sitohy等[25]的方法并稍有改動(dòng)。取經(jīng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的供試菌液平均分為2 組，一組加入無(wú)菌曲酸溶液，至質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL，另一組加入等量無(wú)菌水做空白對(duì)照。適宜溫度恒溫?fù)u床培養(yǎng)6 h后6 500 r/min離心10 min，測(cè)定上清液蛋白質(zhì)量濃度。用無(wú)菌水洗滌沉淀后溶解，超聲波破碎20 min后，6 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)的差異顯著性比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所得數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲酸對(duì)供試菌抑制作用2.1.1 最小抑菌濃度

表1 曲酸對(duì)4 株菌株的最小抑菌濃度Table1 Minimal inhibitory concentrations of kojic acid for four strains

最小抑菌濃度用于定量表示抑菌劑的抑菌性能。從表1可以看出，隨著曲酸質(zhì)量濃度升高，其對(duì)供試菌的抑菌效果逐漸增強(qiáng)。熱殺索絲菌對(duì)曲酸最為敏感，0.5 mg/mL時(shí)生長(zhǎng)即被抑制；而假單胞菌和氣單胞菌在曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)生長(zhǎng)被抑制，當(dāng)曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)能完全抑制沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。曲酸對(duì)沙門(mén)氏菌、熱殺索絲、假單胞菌和氣單胞菌最小抑菌質(zhì)量濃度分別為2.0、0.5、1.0、1.0 mg/mL。有學(xué)者研究曲酸對(duì)食品中常見(jiàn)污染菌的抑菌作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，1.0 mg/mL曲酸對(duì)銅綠假單胞菌曲酸既有較強(qiáng)的抑制作用，曲酸對(duì)大腸桿菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為3.0、3.0、4.0 mg/mL[5]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.1.2 抑菌圈直徑

表2 曲酸作用下4 株菌株抑菌圈直徑Table2 Diameters of zone of inhibition of four strains when exposed to kojic acidmm

基于牛津杯法的抑菌圈直徑表征著抑菌劑對(duì)微生物的抑菌效果。由表2可看出，當(dāng)曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)，4 株供試菌均出現(xiàn)抑菌圈，其中熱殺索絲菌抑菌圈直徑最大，為11.157 mm；當(dāng)曲酸質(zhì)量濃度增加至4.0 mg/mL時(shí)，4 株供試菌抑菌圈直徑均增大，氣單胞菌的抑菌圈直徑最大（21.367 mm），假單胞菌次之（18.626 mm）。綜合來(lái)看，曲酸質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)即能抑制4 株菌株的增殖，低質(zhì)量濃度情況下熱殺索絲菌抑菌圈直徑最大，而提高曲酸的質(zhì)量濃度后，假單胞菌和氣單胞菌抑菌圈直徑增加1 倍以上。

2.1.3 液體體系下供試菌生長(zhǎng)曲線

圖1 不同質(zhì)量濃度曲酸作用下沙門(mén)氏菌（A）、熱殺索絲菌（B）、假單胞菌（C）、氣單胞菌（D）生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Salmonella （A）, Brochothrix thermosphacta （B）,Pseudomonads （C） and Aeromonas （D） with different concentrations of kojic acid

全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀可連續(xù)對(duì)微生物生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)微生物培養(yǎng)環(huán)境和數(shù)量發(fā)生變化時(shí)，菌液濃度與其光密度值成正比，根據(jù)光密度值與時(shí)間的變化關(guān)系圖，可推斷出該微生物的生長(zhǎng)狀況[24]。由圖1可以看出，曲酸對(duì)4 株供試菌均有較強(qiáng)的抑制效果。加入0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的曲酸溶液，熱殺索絲菌生長(zhǎng)完全被抑制，45 h內(nèi)菌懸液光密度值基本無(wú)增長(zhǎng)；加入質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg/mL曲酸溶液，假單胞菌、氣單胞菌、沙門(mén)氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期出現(xiàn)不同程度的延遲，而加入2.0、4.0 mg/mL的曲酸溶液，45 h內(nèi)其菌懸液光密度值基本無(wú)增長(zhǎng)。綜合來(lái)看，此結(jié)果與最小抑菌濃度以及抑菌圈直徑數(shù)據(jù)一致，熱殺索絲菌對(duì)曲酸較敏感，低質(zhì)量濃度下曲酸溶液即能完全抑制其生長(zhǎng)；曲酸對(duì)沙門(mén)氏菌、假單胞菌和氣單胞菌的抑制效果類(lèi)似，較高質(zhì)量濃度曲酸溶液能完全抑制其生長(zhǎng)。

2.2 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞膜的抑菌機(jī)理

2.2.1 曲酸對(duì)菌株表面疏水性的影響

表3 曲酸對(duì)菌株表面疏水性變化的影響Table3 Effect of kojic acid on surface hydrophobicity of strains

十六烷具有較強(qiáng)的疏水性，且對(duì)微生物細(xì)胞無(wú)明顯損傷作用[22]。通過(guò)測(cè)定十六烷對(duì)供試菌吸附率的變化判定菌體表面疏水性物質(zhì)的含量變化，可以反映菌株細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化情況。從表3可以看出，4 株供試菌經(jīng)曲酸處理后十六烷吸附率由空白對(duì)照組的5.0%、5.7%、3.7%和24.8%分別上升至12.1%、18.2%、5.0%和28.4%。沙門(mén)氏菌和熱殺索絲菌較空白對(duì)照組升高了2～3 倍，假單胞菌升高1.5 倍左右。同時(shí)可發(fā)現(xiàn)，由于不同微生物組成細(xì)胞膜的各物質(zhì)成分及含量的不同，曲酸對(duì)不同微生物細(xì)胞膜疏水性的影響也不盡相同，如沙門(mén)氏菌和熱殺索絲菌空白對(duì)照組吸附率較低，但經(jīng)處理后變化幅度最高；而氣單胞菌空白對(duì)照組表面疏水性物質(zhì)含量最高，但曲酸處理后吸附率變化幅度較小。推測(cè)曲酸對(duì)冷鮮鴨肉中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果可能與曲酸促使菌株細(xì)胞膜上疏水物質(zhì)暴露有關(guān)。

2.2.2 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞膜滲透性的影響

表1 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞膜滲透性的影響Table1 Effect of kojic acid on cell membrane permeability of strains

利福平及紅霉素是具有疏水性功能的物質(zhì)，當(dāng)微生物細(xì)胞外膜遭受破壞時(shí)，其選擇滲透性便會(huì)降低，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)外環(huán)境營(yíng)養(yǎng)的吸收能力降低，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[26]。由表4可以看出，經(jīng)過(guò)4 mg/mL曲酸處理后，熱殺索絲菌和氣單胞菌光密度值雖然有所下降，但不顯著（P＞0.05），沙門(mén)氏菌和假單胞菌光密度值顯著下降（P＜0.01，P＜0.001）。其中紅霉素和利福平組均以假單胞菌變化最為明顯，由0.458和0.406分別下降至0.152和0.121 ，分別下降了66.8%和70.2%，沙門(mén)氏菌下降幅度分別為23.9%和30.7%。結(jié)果顯示，曲酸處理能降低菌株細(xì)胞膜表面的選擇滲透性功能，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)外環(huán)境營(yíng)養(yǎng)的吸收能力降低，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.2.3 曲酸對(duì)菌株胞內(nèi)Ca2＋、K＋、Mg2＋泄漏的影響

表5 曲酸對(duì)菌株細(xì)胞內(nèi)Ca2＋、K＋、Mg2＋濃度變化的影響Table5 Effect of kojic acid on changes in intracellular Ca2+, K+ and Mg2+ levels of strains mmol/L

如表5所示，經(jīng)曲酸處理后，處理組培養(yǎng)液中3 種離子濃度均高于空白對(duì)照組。曲酸作為帶正電荷陽(yáng)離子多聚肽，接觸菌株細(xì)胞后會(huì)造成菌株細(xì)胞膜上電荷分布不均勻，從而破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。同時(shí)，經(jīng)曲酸處理后已破損的細(xì)胞釋放的胞內(nèi)離子會(huì)進(jìn)一步破壞培養(yǎng)液中的電荷平衡，從而進(jìn)一步瓦解細(xì)胞。此結(jié)果與ε-聚賴(lài)氨酸損傷大腸桿菌細(xì)胞，引起大腸桿菌胞內(nèi)Ca2＋、K＋、Mg2＋泄漏的情況類(lèi)似[22]。

2.2.4 掃描電子顯微鏡觀察曲酸對(duì)菌株細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 菌株掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopic images of strains

如圖2所示，各組供試菌株處理前形狀規(guī)則、大小均一、光澤度良好、無(wú)破損情況。曲酸處理后，菌體不規(guī)則狀數(shù)量增多、扭曲變形、表面破損嚴(yán)重、孔洞數(shù)量增加，同時(shí)有細(xì)胞內(nèi)容物溢出后聚集成團(tuán)的現(xiàn)象發(fā)生。反映出曲酸對(duì)菌體的細(xì)胞膜有明顯的損傷作用，其抑菌效果可能與其對(duì)細(xì)胞膜的顯著影響密切相關(guān)。類(lèi)似的結(jié)果在Wang Chenjie等[24]研究乳酸對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和李斯特菌細(xì)胞膜損傷的影響中也曾報(bào)道過(guò)。

2.3 曲酸對(duì)菌株胞內(nèi)物質(zhì)的影響

2.3.1 曲酸對(duì)菌株呼吸鏈脫氫酶的影響

氯化碘硝基四氮唑最初是用于分析環(huán)境中具有細(xì)胞呼吸活力的代謝指示劑，它能被活細(xì)胞中的呼吸鏈脫氫酶裂解成四氮唑環(huán)，從而將水溶性的氯化碘硝基四氮唑還原為脂溶性的碘硝基四氮唑甲，并產(chǎn)生顏色的變化。紅四氮唑晶體沉積在質(zhì)膜上，可以用顯微鏡直接觀察，也可以用有機(jī)溶劑萃取后通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定其溶液的顏色深淺，反映細(xì)胞總呼吸活力或電子傳遞鏈的脫氫酶活性[27]。

圖3 曲酸對(duì)菌株呼吸鏈脫氫酶的影響Fig.3 Effect of kojic acid on respiratory chain dehydrogenase activity of strains

由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，處理組顏色均較淺，一定程度上說(shuō)明經(jīng)過(guò)曲酸處理，菌株細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈脫氫酶遭到了破壞，曲酸可以通過(guò)破壞呼吸鏈從而抑制菌株的生長(zhǎng)。比較而言，熱殺索絲菌處理組和空白對(duì)照組顏色差異較小，沙門(mén)氏菌處理組光密度值較空白對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），曲酸處理對(duì)沙門(mén)氏菌呼吸連脫氫酶影響較明顯，對(duì)熱殺索絲菌的影響則較小。

2.3.2 曲酸對(duì)菌株胞內(nèi)β-半乳糖苷酶及堿性磷酸酶的影響

堿性磷酸酶位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，不能向外分泌到細(xì)胞外，而β-半乳糖苷酶存在于細(xì)胞膜內(nèi)，正常情況下，在胞外也是不能檢測(cè)到的，只有當(dāng)細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜受到外界刺激破壞時(shí)，細(xì)胞膜出現(xiàn)裂口，這2 種酶才會(huì)泄漏到胞外[28-29]。

圖1 曲酸對(duì)菌株菌懸液β-半乳糖苷酶（A）和堿性磷酸酶（B）活力的影響Fig.1 Effect of kojic acid on β-galactosidas （A） and alkaline phosphatase （B） activity in bacterial suspension

從圖4A可看出，經(jīng)曲酸處理后其胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活力有所增加，沙門(mén)氏菌、熱殺索絲菌、假單胞菌和氣單胞菌活力較空白對(duì)照組分別增加21.30%、17.40%、21.20%和47.40%。曲酸對(duì)菌株胞內(nèi)堿性磷酸酶的影響（圖4B）可看出，除氣單胞菌外，其余未加入曲酸的3 組空白對(duì)照組菌液中堿性磷酸酶活力顯著低于處理組（P＜0.05），其中假單胞菌變化最為明顯，變化量高達(dá)22.56 倍，沙門(mén)氏菌次之，為3.14 倍。以上結(jié)果表明，曲酸能破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞壁，使內(nèi)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而擾亂細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，阻礙其生長(zhǎng)，此結(jié)果與黃酒多酚、茶多酚的抑菌效果[29-31]類(lèi)似。

2.3.3 曲酸對(duì)菌體蛋白的影響

蛋白質(zhì)的合成分解是微生物生命活動(dòng)的重要環(huán)節(jié)，蛋白質(zhì)作為酶、運(yùn)載體、受體及離子通道等在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

圖5 曲酸對(duì)菌體蛋白的影響Fig.5 Effect of kojic acid on bacterial protein

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）來(lái)看，與空白對(duì)照組相比，曲酸處理6 h后，4 株菌株培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)量濃度均顯著上升（P＜0.05），其中以氣單胞菌上升幅度最為明顯，由0.055 g/L上升至0.159 g/L，上升至接近3 倍，沙門(mén)氏菌次之，由0.109 g/L增加至0.194 g/L，上升至接近2 倍，此結(jié)果與蔗糖癸酸酯對(duì)沙門(mén)氏菌的作用[32]類(lèi)似。與空白對(duì)照組相比，經(jīng)曲酸處理后4 株菌株培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)差異明顯，相關(guān)條帶暗淡，66.4 kDa以上的大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)基本消失，20.1 kDa以下富集的小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)減少，其中曲酸對(duì)氣單胞菌和假單胞菌的蛋白質(zhì)影響更為明顯，表現(xiàn)為大分子條帶稀少，富集的小分子條帶消失。整體來(lái)看，曲酸處理導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)外流，使處理組蛋白質(zhì)量濃度明顯上升，同時(shí)干擾蛋白質(zhì)的新陳代謝，阻礙大分子蛋白質(zhì)的合成或加速小分子蛋白的分解。

3 結(jié) 論

曲酸對(duì)4 株菌株均具有良好的抑制作用。熱殺索絲菌對(duì)曲酸處理敏感，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，液體體系下低質(zhì)量濃度曲酸溶液處理即能完全抑制其生長(zhǎng)。隨著曲酸質(zhì)量濃度增加，沙門(mén)氏菌、假單胞菌和氣單胞菌的抑菌圈直徑增加，假單胞菌和氣單胞菌更加明顯，其抑菌圈直徑增加1 倍以上，2 mg/mL質(zhì)量濃度曲酸處理在液體體系中能完全抑制3 株菌株的生長(zhǎng)。

曲酸處理能夠有效改變4 株菌株的細(xì)胞膜和相關(guān)酶的特性。曲酸處理提高了細(xì)胞膜的疏水性1～2 倍，并降低了細(xì)胞膜表面的滲透性和導(dǎo)致菌株細(xì)胞膜破裂，形成孔洞，增加了菌株培養(yǎng)液中Ca2＋、K＋、Mg2＋離子濃度。同時(shí)，曲酸處理影響了菌株胞內(nèi)酶活性，其中呼吸鏈脫氫酶遭到嚴(yán)重破壞，β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等內(nèi)容物質(zhì)泄漏。

曲酸處理能干擾菌體蛋白質(zhì)的新陳代謝，阻礙菌體細(xì)胞膜上高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的合成，并加速小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子的分解。曲酸處理導(dǎo)致菌株培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)量濃度顯著上升，菌體中大于66.4 kDa和小于20 kDa的蛋白質(zhì)同時(shí)減少。