傳統自然發酵酸肉中細菌群落多樣性與風味品質分析

米瑞芳，陳 曦,，熊蘇玥，戚 彪，李家鵬,，喬曉玲，王守偉，張立升

（1.中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068；2.北方工業大學理學院，北京 100144）

酸肉是將預處理后的原料肉切塊或切片，加入鹽、米粉等密封，自然發酵加工而成的傳統發酵肉制品。酸肉歷史悠久，主要產于貴州、湖南、云南、四川等地區，具有保質期長、風味獨特、富含游離氨基酸和活性肽等特點，近年來越來越受到關注[1-4]。傳統酸肉多為自然發酵，自然發酵可以網羅多種多樣的微生物，賦予酸肉獨特風味。酸肉生產所采取的工藝、環境條件和地區差異可以篩選和富集不同類型和代謝特征的菌群，但受氣候、人為操作等因素影響，酸肉的品質穩定性難以得到保證。因此，了解酸肉中微生物群落結構組成是調控和提升產品品質的關鍵。

國內對傳統自然發酵酸肉的微生物群落研究主要還是應用傳統培養、分離、純化以及進行一系列生理生化實驗等手段[5-8]，也有利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳方法進行研究的報道[9]。基于宏基因組深度測序技術又稱為高通量測序技術，具有檢測通量高、準確度高、用時短等優點，已越來越多地應用于發酵食品微生物生態學研究。高通量測序不需要對微生物進行分離培養，就可以檢測到低豐度的微生物，同時還能更加全面而準確地反映樣品的微生物群落構成和多樣性。在發酵肉制品中，近年來有一些關于應用高通量測序技術對發酵香腸微生物多樣性的研究報道[10-12]，然而目前尚鮮見利用該技術對傳統發酵酸肉的細菌群落多樣性進行研究的報道。

本研究采集云南地區4 種具有代表性工藝的傳統酸肉樣品，利用基于半導體測序技術的Ion S5 XL平臺單端測序方法，評估酸肉中細菌群落結構和多樣性；同時結合電子鼻和固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）分析，揭示細菌群落結構與酸肉風味品質的關系，加深對酸肉發酵機制的認識，從而為傳統產業的現代化改造和食品質量安全控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種酸肉樣品，分別采集自云南當地4 家不同的酸肉生產手工作坊。各樣品均采集3 份，于－80 ℃保存備用。酸肉樣品基本信息見表1。

表1 酸肉樣品基本信息Table1 Information about sour meat samples tested in this study

細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶 大連寶生物工程有限公司；C5～C20系列正構烷烴標準溶液 美國Sigma公司；氦氣（＞99.999%） 北京氦普北方氣體工業有限公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop One超微量紫外-可見光分光光度計、Ion S5 XL測序儀、TG-Wax MS色譜毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、1310型GC-TSQ 8000型三重四極桿MS聯用儀 美國Thermo Scientific公司；Centrifuge 5417R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；T100TMThermal Cycler型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；57330-U SPME手動進樣器、50/30 μm聚二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）SPME針 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌群落的高通量測序分析

取采集的酸肉樣品各25 g，加入225 mL無菌生理鹽水，均質拍打后4 ℃搖床振蕩30 min，靜置10 min后取上清液離心收集沉淀[13]，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取微生物群落總DNA。DNA純度（A260nm/A280nm、A260nm/A230nm）及濃度采用NanoDrop One超微量紫外-可見光分光光度計測定。每種酸肉做4 個平行重復，4 種酸肉共計16 個DNA樣本送至北京諾禾致源股份有限公司，采用341F-806R為引物擴增細菌16S V3～V4區后，進行高通量測序文庫的構建和基于Ion S5 XL平臺的單端測序。測序數據經過處理后[14-15]，利用Uparse軟件以一致性97%作為標準劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），采用Silva數據庫進行比對[16]。利用QIIME軟件計算Alpha多樣性指數并繪制基于Weighted UniFrac距離的非加權組平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法得到聚類樹。

1.3.2 電子鼻檢測分析

PEN3型電子鼻傳感器含有10 種金屬氧化物半導體型化學傳感元件，每種傳感元件對應的敏感物質類型不同[17]。準確稱取2.0 g酸肉樣品于頂空瓶中，加蓋密封，利用PEN3型電子鼻傳感器對酸肉樣品進行檢測。測定條件：頂空溫度50 ℃；頂空時間300 s；進樣流量300 mL/min；信號采集時間90 s；傳感器清洗時間250 s。每個樣品分別做5 次平行重復。利用Winmuster軟件對電子鼻檢測結果進行主成分分析（principal component analysis，PCA）并繪圖。

1.3.3 揮發性風味物質測定分析

SPME條件：準確稱取5.0 g酸肉樣品于15 mL SPME小瓶中，置于50 ℃恒溫水浴鍋中預熱平衡20 min，將經老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入小瓶，50 ℃萃取30 min 后，迅速將萃取頭置于230 ℃進樣口解吸5 min[18]。

GC條件：TG-Wax MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，氦氣流速1 mL/min；進樣口溫度230 ℃。升溫程序：參照Gutsche等[19]并略作修改，起始溫度40 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升至50 ℃；再以4 ℃/min升至120 ℃；最后以12 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度280 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍35～400 u，全掃描模式采集信號。

定性與定量分析：根據所得MS圖，檢索NIST數據庫，結合C5～C20系列正構烷烴混標計算保留指數（retention indice，RI），對酸肉的揮發性組分進行定性分析，計算每種組分的平均含量[18]。

1.4 數據處理

利用SPSS 19軟件進行顯著性分析（P＜0.05）和Pearson相關性分析（P＜0.05），利用Sigmaplot 12.5軟件進行柱形圖繪制。

2 結果與分析

2.1 不同種類酸肉中細菌群落多樣性分析

2.1.1 細菌群落的OTUs聚類分析

圖1 測序數據統計Fig.1 Statistics of tags annotation in sour meat samples

圖2 各樣品中細菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction analysis of pyrosequencing reads for bacteria from sour meat samples

由圖1可知，Y1、Y2、Y3和Y4樣本所獲得的細菌原始序列條數（總tags數）平均值分別為110 117、111 138、110 177 條和110 151 條，序列平均長度429 bp。如圖2所示，所有樣品的稀釋曲線都已進入平臺期，說明測序數據量合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有微生物，更多的數據量對發現新的OTUs邊際貢獻很小。其中Y4細菌的平均OTUs值顯著高于其他3 個（P＜0.05），達到187，而Y1、Y2、Y3之間無顯著性差異，分別為146、149和145。其中4 種樣品共有的細菌種類為112 個。

2.1.2 細菌群落的豐度分析

圖3 基于加權UniFrac距離的UPGMA聚類樹Fig.3 UPGMA cluster dendrogram of sour meat samples based on the Weighted UniFrac distance

如圖3所示，4 種酸肉樣品中主要存在11 個細菌類群，分別是厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、藍藻細菌、擬桿菌門、浮霉菌門、裝甲菌門、疣微菌門、酸桿菌門等。4 種酸肉所含物種基本相似，主要優勢菌是厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。其中厚壁菌門占絕對優勢，相對豐度分布為Y2（98.92%）＞Y4（97.80%）＞Y3（86.85%）＞Y1（83.73%）；其次是變形菌門，分別為Y1（15.70%）＞Y3（11.30%）＞Y4（1.58%）＞Y2（0.32%）；放線菌門分別為Y3（1.67%）＞Y4（0.33%）＞Y1（0.29%）＞Y2（0.22%）。另外，通過聚類分析可知Y1和Y3距離最近，其微生物種類和數量最為相似，這可能與其工藝較為相似有關。

表2 酸肉樣品中優勢細菌菌屬（前20）及其在各樣品中的相對豐度Table2 Abundances of predominant bacteria (top 20) in four sour meat samples%

如表2所示，進一步對細菌群落中主要優勢菌屬（前20 位）進行分析。不同種類酸肉中細菌菌屬結構存在一定差異。厚壁菌門中，乳桿菌屬占絕對優勢，在所有樣品中的相對豐度為31.28%～74.27%，這與利用傳統培養方法研究酸肉微生物群落的結果較為一致，例如李宗軍等[8]在酸肉發酵過程中檢測到的優勢細菌是乳桿菌、片球菌、明串珠菌和微球菌等；周才瓊等[20]在渝黔地區傳統酸肉中檢測到的優勢細菌也是乳桿菌和片球菌；陳韻等[9]從貴州侗族發酵肉中檢測到優勢細菌為乳桿菌和葡萄球菌。在其他發酵肉制品例如發酵香腸中，利用高通量測序研究也發現乳桿菌是主要優勢細菌，例如Quijada等[10]利用高通量測序技術研究干發酵香腸中的微生物群落，其中乳桿菌屬占比為65.1%～92.0%；Fontana等[21]利用高通量測序技術研究駱駝肉發酵香腸中的乳酸菌群落，結果表明優勢菌是乳桿菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬等。其次是魏斯氏菌屬，Y4和Y2樣品中相對豐度較高，分別為60.00%和17.93%，遠高于Y1和Y3。乳球菌、片球菌、葡萄球菌等也是厚壁菌門中的優勢菌屬。變形菌門中，Y2和Y4中腸桿菌含量遠低于Y1和Y3，而且未檢出大腸埃希氏菌-志賀氏菌群（大腸埃希氏菌和志賀氏菌16S rDNA序列幾乎完全一致，進一步區分需要生化及血清分型）。這可能與某些魏斯氏菌可產細菌素有關[22]，從而保證酸肉的質量安全性。放線菌門和擬桿菌門中，各樣品中大部分菌屬的相對豐度都低于0.1%。

2.2 不同種類酸肉中揮發性風味物質分析

2.2.1 酸肉樣品的整體風味分析

圖4 利用電子鼻檢測不同酸肉風味的PCA圖Fig.4 PCA plot of volatile compounds in different sour meat samples distinguished by electronic nose

如圖4所示，第1主成分和第2主成分的方差貢獻率分別為89.35%和10.50%，總貢獻率接近100%，可以代表酸肉樣品的整體信息。圖4中各組分析數據點均分布在各自的區域內，沒有重疊現象，說明4 種傳統發酵酸肉的揮發性氣味有較大差異性。其中Y1和Y3的中心距離最小，說明Y1和Y3的整體風味差異最小，這與細菌群落的分析結果相符（圖3）。

2.2.2 酸肉樣品的揮發性風味物質種類及含量分析

由表3可知，利用SPME-GC-MS技術，在4 種酸肉樣品Y1、Y2、Y3和Y4中分別檢測到52、53、37 種和73 種揮發性風味物質，共計126 種。主要包括酸類14 種、醇類28 種、醛類14 種、酯類24 種、酮類12 種、萜烯類15 種、含硫/含氮類8 種和芳香族類11 種。僅在其中1 種酸肉樣品中檢測到的揮發性物質有77 種，占總揮發性物質種類的61.1%，包括酸類7 種、醇類18 種、醛類11 種、酯類11 種、酮類10 種、萜烯類10 種、含硫/含氮類6 種、芳香族類4 種，說明云南地區傳統酸肉的揮發性物質組成結構差異較大，風味較為多樣化。余冰等[23]從侗族酸肉中檢測到48 種揮發性物質，酯、醛、醇、烷烴和其他雜環化合物分別為13、11、6、5、13 種；周才瓊等[24]從渝黔苗漢雜居地區傳統酸肉中檢測到85 種揮發性物質，酯、醛、醇、酚酸和碳氫化合物分別為23、23、9、3、27 種；張倩等[2]從貴州酸肉中檢測到34 種揮發性物質，酸、醛、烷烴、烯、酯和醇類物質分別為15、11、1、1、3、3 種；黃群等[25]在傳統湘西酸肉中檢測到酯、醛、醚、醇、烴和其他雜環化合物分別有5、3、2、9、19、5 種，共計43 種。這些研究報道進一步表明，不同地區和工藝制作的酸肉具有各自獨特的風味。

如圖5所示，可在2 種或2 種以上酸肉中檢測到的揮發性物質有49 種，其中酸類、醇類和酯類在不同酸肉樣品之間具有較大差異。例如乙酸、辛酸、癸酸在Y4樣品中的含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05），張倩等[2]在貴州酸肉中也檢測到了這3 種物質，但其檢測到的其他酸類物質如油酸、亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸，在本實驗樣品中并未檢測到。醇類物質中含量差異顯著的主要有乙醇、正己醇、順-3-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇和苯乙醇，其中乙醇在4 個樣品中的含量都較高，樣品Y4的乙醇含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05）。乙醇、正己醇、1-辛烯-3-醇（蘑菇香、水果香）、苯乙醇（玫瑰香、甜香）均在侗族酸肉中報道過，且苯乙醇是侗族酸肉的主體風味成分之一[23]，而順-3-己烯-1-醇首次在酸肉中發現。酯類物質中，不同樣品間差異顯著的包括己酸乙酯（果香、酒香）、庚酸乙酯（青香、果香）、乳酸乙酯（果香）、辛酸乙酯（花香、水果香）和癸酸乙酯（蜂蜜香、玫瑰香）等，其中己酸乙酯、乳酸乙酯在Y4樣品中含量均為最高，Y1和Y3次之。據報道，己酸乙酯和辛酸乙酯是侗族酸肉的主體風味物質[23]，癸酸乙酯是渝黔苗漢雜居地區傳統酸肉的主體風味物質[24]，這些乙酯類物質通常能夠賦予產品果香味和酒香味[26]，對酸肉的風味品質形成具有重要貢獻。

圖5 不同酸肉中各揮發性風味化合物的種類數Fig.5 Number of volatile compounds belonging to each chemical class in different sour meat samples

圖6 不同酸肉中各類揮發性風味化合物的相對含量Fig.6 Relative percentages of each class of volatile compounds in different sour meat samples

另外，本實驗中檢測到的芳樟醇、α-松油醇、茴香腦、右旋萜二烯、3-蒈烯、1-石竹烯、大根香葉烯等化合物是八角茴香和花椒的主要成分，在Y2和Y4樣品中的含量較高，可能與不同酸肉制作時采用的工藝配方有關。如圖6所示，4 種酸肉樣品中檢測到的醛類、酮類、含硫/含氮化合物的相對含量都較低，Y2和Y3中檢測到少量的二甲基三硫化物，二甲基三硫化物具有令人不愉快的味道，含量過高可能會影響產品風味[27]；Y4樣品中還檢測到吡嗪類含氮化合物，吡嗪類化合物主要呈現出豆豉、堅果風味[28]，這是首次在酸肉中檢測到該類化合物。

2.2.3 酸肉揮發性風味物質與微生物的關系

如表3所示，4 種酸肉樣品中的主要酸類物質均為乙酸，而優勢微生物均為乳桿菌、魏斯氏菌等乳酸菌（表2）。乳酸菌對發酵肉制品風味的貢獻主要是通過分解代謝碳水化合物、氨基酸等產生有機酸[29-30]。其中Y4樣品的總酸含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05），這可能是由于Y4中某些細菌（例如魏斯氏菌）具有較強的產酸能力[31]，大大提高了該樣品中有機酸例如乙酸、辛酸、癸酸的含量（均與其他3 個樣品差異顯著，P＜0.05），同時相關性分析表明乙酸與魏斯氏菌呈極顯著正相關（Pearson相關系數0.995，P＜0.01）。

由圖5、6可知，所有酸肉樣品中醇類和酯類物質的種類數和相對含量都較高。這可能是由于細菌對碳水化合物的代謝和脂質氧化可產生并不斷積累醇類物質，例如異型發酵的乳酸菌可產生乙醇，而有研究表明乳酸菌也會影響發酵香腸的脂肪氧化速率[32]。所有酸肉樣品中的酯類物質均以乙酯類為主，乙酯類物質占酯類物質的85%以上，而有研究報道成熟發酵香腸中的酯類物質也以乙酯類為主[33]。由于原料豬肉中的酯類物質含量較低，且以甲酯類為主[34-35]，因此酸肉中酯類物質的形成主要與發酵相關。本實驗中檢測到的乙酯類物質主要有乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。乳桿菌在酸肉中占絕對優勢地位，其代謝產物乳酸是形成乳酸乙酯及其他香味成分的重要物質基礎[36]；明串珠菌可利用碳水化合物進行異型發酵產生D型乳酸和乙酸，分別是乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體物[37]。Y4樣品中的乙醇含量顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05），醇與酸反應生成酯類，這可能是Y4樣品中己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、癸酸乙酯等乙酯類物質都顯著高于其他3 個樣品的原因。另外，樣品Y1和Y3中，己酸乙酯、乳酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯等均無顯著性差異，這可能是由于這2 種酸肉制作工藝較為類似，導致其微生物群落結構較為相似（圖3）。

續表3

續表3

3 結 論

本研究運用高通量測序技術對采集的4 種傳統發酵酸肉的細菌群落進行檢測。結果表明傳統發酵酸肉中細菌多樣性豐富，包含11 個門，其中厚壁菌門占絕對優勢，約占總細菌群落的83.73%～98.92%，其次是變形菌門和放線菌門。主要優勢菌屬為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳球菌屬。與傳統分離培養方法相比，高通量測序具有檢測通量高、準確度高、用時少等優點。同時，利用SPME-GC-MS，從酸肉樣品中檢測到酸類、醇類、醛類、酯類、酮類、萜烯類等揮發性風味化合物共9 大類126 種。結果表明4 種酸肉樣品之間的菌屬種類和相對豐度均存在一定的差異性，同時酸肉樣品中的風味物質在種類和含量上也存在較大差異性。結果表明乳桿菌、魏斯氏菌等微生物，可能影響酸肉中醇類、酯類和酸類揮發性風味物質，從而影響酸肉的風味品質。本研究結果為深入了解傳統自然發酵酸肉的微生物群落與風味的相關性、開發酸肉專用細菌劑提供數據支撐和參考依據。