紅曲黃酒來源芽孢桿菌普魯蘭酶基因克隆和生物信息學分析

徐友強，孫寶國，蔣玥鳳，侯 潔，許春艷，王文華，滕 超，熊 科，范光森，李秀婷,

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京工商大學，北京 100048；2.北京工商大學食品學院，北京 100048；3.北京市食品風味化學重點實驗室，北京工商大學，北京 100048）

紅曲黃酒是我國的代表性黃酒之一，其成品色紅、味醇、香濃，獨具特色[1]。紅曲黃酒釀造以大米為原料，大米淀粉質量分數在70%以上，淀粉的水解，即液化和糖化，是黃酒釀造原料的主要轉化過程之一，并為微生物生長提供碳源[2]。淀粉水解速度對于釀造體系微生物的生長及代謝具有顯著影響，如果液化和糖化速度過慢，則微生物因缺乏碳源而生長代謝緩慢；如果液化和糖化速度過快，會造成發酵醪中糖濃度過高，進而抑制微生物的代謝[3]。因此，淀粉水解對于黃酒的釀造過程和產品品質影響極大，而決定釀造體系淀粉水解的內在主要源動力，即為微生物來源的淀粉酶[4]。

表1 紅曲黃酒來源的主要微生物Table1 Major microorganisms originated from Hongqu glutinous rice wine

傳統紅曲黃酒釀造過程有多種微生物共同參與[5]。微生物可以產生淀粉酶，以降解原料大米中的淀粉，是釀造過程原料中淀粉轉化的內在原動力[4]。已有研究通過現代微生物學和分子生物學技術結合傳統微生物分離培養，對紅曲黃酒釀造過程真菌和細菌區系變化規律進行分析，并從酒藥和釀造過程樣品中分離大量霉菌、酵母菌和細菌資源（表1）[6-13]。研究表明，傳統紅曲黃酒釀造過程是霉菌、酵母菌和細菌共同參與的結果[6-13]，并且多種微生物具有產生淀粉酶的能力[14-19]。紅曲黃酒釀造真菌來源的淀粉酶主要為α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶[18-19]，主要作用于淀粉的內部不規則切開直鏈淀粉的α-1,4-糖苷鍵，但不水解支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵，也不水解靠近α-1,6-糖苷鍵的α-1,4-糖苷鍵，而大米淀粉中支鏈淀粉的含量在75%以上，因而酶解產物主要是麥芽糖、少量葡萄糖以及一系列分子質量不等的低聚糖和糊精[18]。這兩種酶均難以越過支鏈淀粉分子中的α-1,6-糖苷鍵分支點，導致紅曲黃酒釀造周期相對較長，原料利用率普遍較低[20]。

與真菌所產淀粉酶種類不同，細菌除產生α-淀粉酶外，還可以產生β-淀粉酶和普魯蘭酶等[21]。其中，普魯蘭酶可以作用于支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵，即可以特異性水解普魯蘭多糖，有助于淀粉的充分水解。基于作用底物和產物的差異，目前普魯蘭酶主要分為I型普魯蘭酶、II型普魯蘭酶、I型普魯蘭糖水解酶、II型普魯蘭糖水解酶和III型普魯蘭糖水解酶[22]。I型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）作用于支鏈低聚糖的α-1,6-糖苷鍵，產物為麥芽三糖；II型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）可作用于α-1,4-和α-1,6-糖苷鍵，水解產物包括葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖；I型普魯蘭糖水解酶（EC 3.2.1.135），又名Neopullulanase，主要在非還原端水解α-1,4-糖苷鍵，產物是潘糖；II型普魯蘭糖水解酶（EC 3.2.1.57），又名Isopullulanase，主要作用于α-1,4-糖苷鍵，水解產物為異葡糖基麥芽糖；III型普魯蘭糖水解酶（EC 3.2.1.-）可作用于α-1,4-和α-1,6-糖苷鍵，水解產物為潘糖、麥芽糖和麥芽三糖。基于這類酶的特性，細菌來源普魯蘭酶在黃酒釀造的淀粉水解過程中應具有重要的作用。但是到目前為止，紅曲黃酒微生物淀粉酶的研究仍局限于真菌，特別是霉菌高產淀粉酶菌株的選育及應用[14-16]，該過程細菌產普魯蘭酶的相關研究鮮見報道，不利于全面認知紅曲黃酒釀造的淀粉水解過程，制約了釀造機制的深入解析，進而導致紅曲黃酒釀造效率較低，并且不同批次產品品質穩定性差。前期研究發現，細菌中的芽孢桿菌屬菌株存在于紅曲黃酒整個釀造過程中，是紅曲黃酒釀造的典型代表性微生物[5,23-24]，且具有表達普魯蘭酶的能力[10]。基于上述研究現狀，在前期從紅曲黃酒釀造酒曲中分離具有淀粉水解能力的芽孢桿菌基礎上，本實驗對芽孢桿菌所攜帶普魯蘭酶的基本性質進行全面的生物信息學分析，以為后續的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌BHQ03、BHQ04和BHQ06由前期工作分離獲得，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，基因測序委托華大基因完成。克隆載體pEASY-T1、Trans Taq-T DNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司；Escherichia coli DH5α感受態細胞、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；BIOMIGA Gel/PCR Extraction Kit 北京拜爾迪生物技術有限公司。

LB培養基：酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0，LB固體培養基加入2%瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

紫外透射反射分析儀 上海康華生化儀器制造廠；Microfuge 20R高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；T100TM基因熱循環儀 美國Bio-Rad公司；DYY-III-8B穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定

在前期工作中，研究通過芽孢桿菌培養基對紅曲黃酒酒曲中的芽孢桿菌進行分離和純化，繼而利用淀粉平板對篩選的芽孢桿菌進行培養，依據平板水解圈的大小對菌株的淀粉水解性能進行評估，獲得3 株具有顯著淀粉水解性能的芽孢桿菌，編號BHQ03、BHQ04和BHQ06，分別接種培養12 h，離心收集菌體，按照細菌基因組DNA試劑盒操作步驟提取基因組DNA。利用細菌16S rRNA基因克隆引物27f和1492r進行PCR擴增獲得芽孢桿菌的16S rRNA基因[25]，擴增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，循環30 次；72 ℃、10 min，4 ℃恒溫。

1.3.2 普魯蘭酶基因克隆與測序

根據菌種鑒定結果，NCBI檢索近源芽孢桿菌基因組信息，依據注釋普魯蘭酶基因序列，設計簡并引物（表2），進行普魯蘭酶基因的擴增，擴增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、2.5 min，循環30 次；72 ℃、10 min，4 ℃恒溫。

表2 菌種鑒定和普魯蘭酶基因擴增引物Table2 Primers used for strain identification and amplification of the pullulanase genes

擴增所得DNA條帶，通過BIOMIGA膠回收試劑盒進行DNA條帶純化，然后按照pEASY-T1載體說明書要求進行普魯蘭酶基因的連接，轉化E. coli DH5α感受態細胞，通過藍白斑篩選挑取陽性克隆子，送至華大基因進行普魯蘭酶基因序列測定。

1.3.3 系統發育分析

菌種鑒定系統發育樹構建：將測序所得16S rRNA基因序列提交EzbioCloud細菌專業分類鑒定在線網站（https：//www.ezbiocloud.net/taxonomy），將序列相似性大于等于97%的序列下載到本地，按照系統發育分析軟件MEGA 5.0要求制作序列比對文件，通過Neighbour-Joining算法構建系統發育樹，Bootstrap values為1 000。

蛋白質系統發育樹構建：選取代表性的不同普魯蘭酶亞家族蛋白序列，參照菌種鑒定系統發育樹構建步驟構建蛋白質系統發育樹。

1.3.4 普魯蘭酶序列和基本性質分析

序列拼接及比對選用DNAMAN 7.0軟件完成、信號肽的預測通過SignalP 4.1網站進行（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、理化性質分析采用ExPASy-ProtParam tool完成（http：//web.expasy.org/protparam/）。

1.3.5 普魯蘭酶親/疏水性及跨膜區分析

蛋白親水/疏水性分析提交預測軟件ExPASy-ProtScale完成（http：//web.expasy.org/protscale/），利用在線軟件TMHMM 2.0進行蛋白跨膜區的預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。

1.3.6 普魯蘭酶二級、三維結構預測和催化機制分析

蛋白二級結構利用軟件SOPMA Secondary Structure Prediction Method（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進行分析。蛋白三維結構預測通過SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）完成。分子對接通過DISCOVERY STUDIO 2.5軟件完成。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

16S rRNA基因系統發育分析表明，3 株菌在系統發育樹上與B. wiedmannii、B. thuringiensis、B. toyonensis、B. pseudomycoiders和B. cereus聚于同一分支，表明親緣關系較近（圖1），BHQ03與B. cereus、B. wiedmannii、B. thuringiensis、B. toyonensis和B. pseudomycoides的同源性分別為100.00%、99.82%、99.45%、99.45%和99.45%；BHQ04與B. wiedmannii、B. cereus、B. thuringiensis、B. toyonensis和B. pseudomycoides的同源性分別為100.00%、99.83%、99.66%、99.66%和99.31%；BHQ06與B. wiedmannii、B. cereus、B. thuringiensis、B. toyonensis和B. pseudomycoides的同源性分別為100.00%、99.85%、99.55%、99.55%和99.41%。進一步序列分析發現與BHQ03相比，BHQ04與BHQ06親緣關系更近。因此，后續以BHQ03和BHQ06為研究對象，選取16S rRNA基因序列相似性最高的B. wiedmannii、B. toyonensis、B. thuringiensis和B. cereus共4 株菌基因組注釋普魯蘭酶基因序列設計引物。由于B. cereus基因組注釋普魯蘭酶基因序列與其余3 株菌差異較大，為降低引物的簡并性，以B. cereus基因組注釋普魯蘭酶基因序列單獨設計引物，然而PCR擴增并未獲得預期目標基因。以B. wiedmannii、B. toyonensis和B. thuringiensis基因組注釋普魯蘭酶基因序列設計引物，其中，Pullulanase.f1/Pullulanase.r1的參考基因序列NCBI登錄號：AT260_RS18700、BTOYO_RS09760和CAB88_RS24225；Pullulanase.f2/Pullulanase.r2的參考基因序列NCBI登錄號：AT260_RS06110、BTOYO_RS00120和CAB88_RS13920。

圖1 芽孢桿菌16S rRNA基因系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Bacillus strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 普魯蘭酶基因克隆和序列解析

上述分離的2 株Bacillus sp.均攜帶2 個普魯蘭酶基因，且同一菌株來源的2 個基因在序列上差別較大，比如菌株BHQ03的2 個普魯蘭酶基因pulL1和pulL2序列相似度僅有19.72%，但是2 株菌對應的普魯蘭酶基因序列相似度較高，測序和比對結果表明，pulL1和pulL3的長度均為2 142 bp，共有79 個堿基存在差異，序列相似度達96.31%，pulL2和pulL4的長度均為2 559 bp，僅有6 個堿基存在差別，序列相似度達99.77%。從基因進化角度講，pulL2和pulL4較pulL1和pulL3在進化上更加保守。將上述4 個普魯蘭酶編碼基因提交到NCBI，登錄號分別為：pulL1（MG971224）、pulL2（MG971225）、pulL3（MG971226）和pulL4（MG971227）。

圖2 普魯蘭酶基因克隆和序列測定結果Fig.2 Cloning and sequencing of the pullulanase genes

2.3 普魯蘭酶基本性質和序列比對分析

表3 普魯蘭酶基本性質分析Table3 Analysis of the basic characteristics of the pullulanases

對普魯蘭酶的基本性質包括氨基酸殘基數量、分子質量、等電點、帶負電荷氨基酸、帶正電荷氨基酸、分子式、原子總數、消光系數和不穩定指數進行分析，結果見表3。上述基本酶學性質的分析，有助于后續蛋白質的分離純化和性質研究。其中，4 個酶的不穩定指數均小于40，說明蛋白本身在結構上是穩定的[26]。研究發現，蛋白穩定性的決定因素之一在于其序列中的二肽[26]，PulL1、PulL2、PulL3和PulL4之間的氨基酸組成存在差異（表3），導致其序列中的二肽存在不同，是不同普魯蘭酶不穩定指數差異的主要原因。在基因序列測定和酶基本性質的信息解析基礎上，研究進一步對酶的氨基酸序列進行系統發育和比對分析。

圖3 普魯蘭酶系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the pullulanases

選取代表性普魯蘭酶進行系統發育分析，發現PulL1、PulL2、PulL3和PulL4均屬于I型普魯蘭酶（圖3），隸屬于GH13家族。PulL1和PulL3與B. thuringiensis來源的I型普魯蘭酶進化關系最近，序列相似性分別為99.58%、96.35%，而PulL2和PulL4與B. bombysepticus來源I型普魯蘭酶進化關系最近，序列相似性分別為99.41%、99.77%。I型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）又被稱為真普魯蘭酶、脫支酶，僅作用于α-1,6-糖苷鍵，特異性水解普魯蘭多糖及相關分支多糖，水解產物為麥芽三糖[22]。I型普魯蘭酶不具有水解α-1,4-糖苷鍵的能力，底物專一性好，在直鏈淀粉的生產中具有很好的應用。另外，在實際應用中往往將其與其他類型的淀粉水解酶搭配使用，以有效降解淀粉為小分子單糖或多糖[22]。

普魯蘭酶氨基酸序列比對結果表明，PulL1和PulL3存在25 個氨基酸的差別，序列相似度為96.49%；PulL2和PulL4僅有3 個氨基酸的差別，序列相似度為99.65%（圖4）。序列比對表明，本研究的4 個普魯蘭酶具有I型普魯蘭酶的4 個特征性高度保守區域，雖然PulL2和PulL4的序列相似度非常高，但是在高度保守區域Region II的催化活性中心存在差別，PulL2的D（Asp）突變為G（Gly），說明普魯蘭酶PulL2和PulL4的催化特性可能存在顯著差別（圖4）。研究表明淀粉酶的催化機制雖然相似，但是不同種類淀粉酶底物特異性和產物存在差異，推測原因在于，雖然不同種類淀粉酶的活性中心相同，但高度保守區域特別是活性中心位點附近的氨基酸殘基不同[21,27-28]。對于同種淀粉酶，由于序列，特別是活性中心附近氨基酸序列的差別，也會帶來酶的特性，包括最適溫度和pH值、催化反應動力學等的變化[21]。圖4的比對結果顯示，普魯蘭酶PulL1和PulL2的高度保守區催化活性中心附近的保守區域氨基酸殘基也存在差別，可能影響酶的催化性質，有待后續研究。在上述4 個特征性高度保守區域之外，I型普魯蘭酶還具有1 個特征性的7氨基酸殘基特征區域“YNWGYDP”（圖4標示289～295區域）。文獻研究表明該區域與酶的底物特異性密切相關，使酶特異的水解α-1,6-糖苷鍵[29]。PulL1和PulL3該特征區域存在單氨基酸殘基的突變（D294N），該突變可能對酶催化底物的特異性和催化效率產生影響。

圖4 普魯蘭酶氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment of the pullulanases

2.4 普魯蘭酶疏水性分析、信號肽和跨膜區預測

圖5 普魯蘭酶疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of the pullulanases

采用Hphob/Kyte & Doolittle算法計算PulL1和PulL2的疏水性（圖5）。PulL1疏水指數最小值為－3.411（78位），最大值為2.756（554位），總平均親水性指數（grand average of hydropathicity，GRAVY）為－0.412。PulL2疏水指數最小值為－2.822（336位），最大值為3.289（16位），GRAVY為－0.675。特定位點的氨基酸親水性指數越大，表明該位點的疏水性越高[30]。PulL1和PulL2雖然都是親水性蛋白，但是在氨基酸殘基親水性指數和蛋白的總平均親水性指數均存在差異，說明二者親水性存在差別，但總平均親水性指數均為負值，屬于親水性蛋白。氨基酸的疏水作用在很大程度上影響蛋白的穩定性[31]，氨基酸疏水性分析對于通過定點突變或者區域替換提高蛋白的穩定性具有重要指導作用。

圖6 普魯蘭酶信號肽和跨膜區預測Fig.6 Prediction of the signal peptide and transmembrane domain of the pullulanases

文獻報道，不同I型普魯蘭酶有分泌到胞外[32-33]、結合在細胞膜上[34]和存在于細胞內[35]3 種形式。同一普魯蘭酶也可能形成不同的存在形式，例如，Bacillus sp. S-1來源堿性普魯蘭酶具有兩種存在形式，前體蛋白主要存在于胞內；成熟蛋白可以結合在細胞膜上[36]。圖6表明，PulL2的N-端具有信號肽序列，可以引導其由胞內分泌到胞外，而PulL1并不具有信號肽序列。研究一般認為，沒有信號肽的蛋白不能轉運，即翻譯完畢的蛋白會滯留在合成的區域。因此，生物信息學分析結果說明Bacillus sp.BHQ03來源的2 個普魯蘭酶分別具有分泌到胞外和存在于胞內兩種存在形式。

2.5 普魯蘭酶二級、三維結構預測和催化過程分析

圖7 普魯蘭酶PulL1（A）和PulL2（B）二級結構預測Fig.7 Prediction of the secondary structures of the pullulanases

二級結構預測表明，PulL1的α-螺旋占蛋白質的31.00%，伸展鏈占蛋白質的24.82%，β-折疊占蛋白質的11.64%，無規則卷曲占蛋白質的32.54%（圖7A）；PulL2的α-螺旋占蛋白質的30.75%，伸展鏈占蛋白質的25.94%，β-折疊占蛋白質的10.68%，無規則卷曲占蛋白質的32.63%（圖7B）。可見，對于Bacillus sp. BHQ03來源普魯蘭酶，α-螺旋和無規則卷曲是蛋白結構的主要組成部分，伸展鏈和無規則卷曲分散其間。二級結構的預測對于蛋白的研究具有重要幫助，例如蛋白質二級結構統計分析得到的規則可用于全新蛋白質的設計；當序列同源性較低時，二級結構的預測有助于蛋白之間結構與功能的關系分析；在基于二級結構片段堆積的三級結構預測中首先需要正確的二級結構預測；另外，二級結構的預測有助于多維核磁共振中二級結構的確認和晶體結構的解析[37]。

圖8 普魯蘭酶三維結構同源建模和催化機制分析Fig.8 Homology-based modeling of three dimensional structures and catalytic mechanism analysis of the pullulanases

與PulL1相比，PulL2的N-端（137～219）具有小的結構域（圖8A和8B），文獻表明普魯蘭酶N-端區域的截短有助于酶在異源表達時的可溶性，提高表達效率[38]。原因可能是普魯蘭酶蛋白分子較大，截短后降低了蛋白錯誤折疊的幾率。與N-端相比，PulL1的C-端（624～713）與PulL2的C-端（763～852）在結構上差異較小。以PulL1為對象，對底物普魯蘭糖與酶進行分子對接，確定底物與酶催化活性中心可能成鍵的氨基酸殘基（圖8C、D），解析催化活性中心與底物的作用機制。文獻研究表明，普魯蘭酶的活性中心一般是Asp-Glu-Asp催化三聯體結構，兩個Asp分別行使酶的親核基團和穩定過渡態中間物的作用，Glu參與酸堿催化[21,39]，催化過程共發生二次置換反應（圖8E）。底物的糖殘基首先與酶的活性部位結合，該糖基氧原子被充當質子供體的氨基酸殘基Glu質子化（圖8E II）；活性部位的氨基酸殘基Asp對糖殘基的C1碳原子進行親核攻擊，與底物形成共價中間產物，同時斷裂底物糖苷之間的糖苷鍵，置換出底物的糖基配基部分（圖8E III）；糖基配基離去之后，水分子被氨基酸殘基Glu和另一氨基酸殘基Asp激活，將Asp的親核氧與糖殘基C1之間的共價鍵C1-O-Asp水解掉，置換出酶分子的Asp殘基，完成水解反應（圖8E IV和V）。

3 結 論

本研究對紅曲黃酒釀造酒曲分離的具有淀粉水解特性的芽孢桿菌進行分子生物學初步鑒定和普魯蘭酶基因克隆與生物信息學分析。鑒定結果表明，分離的兩株芽孢桿菌BHQ03和BHQ06與B. thuringiensis、B. pseudomycoides、B. toyonensis、B. wiedmannii和B. cereus的親緣關系較近。基因克隆和測序發現，2 株菌各攜帶2 個不同序列的普魯蘭酶基因。進一步序列分析顯示，BHQ03來源普魯蘭酶PulL1和PulL2均為I型普魯蘭酶，結構穩定，屬于親水性蛋白。PulL2存在信號肽，可以分泌到胞外。兩個普魯蘭酶均具有淀粉水解酶的典型高保守區域，且BHQ03來源的普魯蘭酶PulL2催化活性位點存在突變（D407G），表明該蛋白可能存在催化上的特殊性。基于已有研究和三維結構模擬，分析了普魯蘭酶催化的具體作用過程。

上述研究首次報道紅曲黃酒釀造酒曲來源芽孢桿菌的普魯蘭酶序列和基本生物信息學特性。后續在基因克隆基礎上，擬開展蛋白質的表達、分離純化和性質研究，以進一步解析不同普魯蘭酶，特別是Bacillus sp. BHQ03來源PulL2的淀粉水解特性，為科學認識紅曲黃酒釀造的淀粉水解過程提供依據。