尖孢鐮刀菌LD105產抑菌多糖固態發酵條件優化

鄭露華，李 丹，陳 輝，梁小波，韓 鵬

（昆明理工大學 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500）

真菌多糖近年來被發現具有多種特殊的生物活性，例如：增強機體免疫力、抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖等作用[1-4]，因而逐步成為一個熱門的研究話題。真菌多糖一般可以從真菌的子實體、菌絲體、發酵液中分離出來[5]，有研究發現[6]從真菌中提取的多糖對多種細菌具有較好的抑菌作用，尤其是對一些革蘭氏陰性菌[7]。以往報道中，尖孢鐮刀菌的研究主要集中在其對植物致病機理、分子生物學和生物防治方面[8-9]，研究發現尖孢鐮刀菌水提取物及其多糖具有顯著免疫增強作用[10]，可促進巨噬細胞增殖，增強巨噬細胞吞噬功能，激活巨噬細胞釋放免疫活性因子，可用于免疫功能低下疾病及腫瘤輔助治療。

近年來細菌病害給種植業和畜牧業的生產帶來巨大損失，其中大部分的植物細菌致病菌為革蘭氏陰性菌，因此需要一種廣譜、低毒、低殘留的抗菌劑。本研究以農業麥麩為發酵基質，以尖孢鐮刀菌LD105作為發酵菌種，采用單一微量稀釋法，以多糖產量和抑菌率為評價指標，通過優化固態發酵工藝技術[11]，揭示尖孢鐮刀菌抑菌多糖和發酵條件之間的相互關系，為開發尖孢鐮刀菌多糖潛在應用價值提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

供試菌種：尖孢鐮刀菌LD105從云南省昆明市東川區瑪卡根際土壤中分離；抑菌實驗指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus a u r e u s）、單核細胞性李斯特菌（L i s t e r i a monocytogenes）、沙門菌（Salmonella typhimurium）、志賀氏菌（Shigella castellani） 上海魯能科技有限公司；綠色木霉（Trichoderma viride）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）廣東省微生物菌種保藏中心。

玉米粉、大豆粉、米糠、玉米芯、麥麩（作為不同固態基質種類）購自安徽合肥農作物加工廠，過10～20 目篩，粒徑為0.85～2 mm，50 ℃烘箱干燥，密封常溫保存，備用；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、營養肉湯 北京奧博星生物技術有限責任公司；固態發酵基礎培養基：取10 g麥麩作為發酵基質、含水量60%、葡萄糖2%、KH2PO40.2%、蛋白胨2%、pH值自然。

無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司；濃硫酸 錦州古城化學試劑廠；蛋白胨 北京奧博星生物技術有限公司；苯酚、吐溫-80、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、KH2PO4（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠；蔗糖 廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TS-200電熱恒溫培養箱 上海天城實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺、BXM-30R手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；UV-2450S（E）紫外分光光度計 日本島津公司；XR1臺式高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；SJIA-10N冷凍干燥機 寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；96 孔細胞培養板 美國Costar公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定

尖孢鐮刀菌LD105于含50 μg/mL卡那霉素的PDA培養基培養1 周后，顯微鏡下進行菌落和孢子的形態學觀察，同時對其28S rDNA進行擴增并測序，聚合酶鏈式反應引物為LROR：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’和LRO5：5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’，基因組DNA的提取方法及28S rDNA擴增方法參照文獻[12]進行，擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司代為測序。測序結果經NCBI（美國國立生物技術信息中心）比對并建立系統發育樹。

1.3.2 菌株的培養

斜面培養：將尖孢鐮刀菌接種于PDA斜面，28 ℃恒溫培養4～5 d，備用。

孢子懸浮液配制：用0.1%的吐溫-80清洗平板培養基上的真菌孢子，制成約107CFU/mL孢子的懸浮液，備用。

固態發酵工藝流程：固體培養基配制10 g裝入250 mL錐形瓶→121 ℃滅菌20 min→冷卻至室溫→接種孢子懸浮液→翻拌→28 ℃培養4 d。

1.3.3 水溶性抑菌多糖的提取與測定

取麥麩固態發酵產物加入5 倍去離子水，并攪拌均勻，沸水浴浸提1 h，8 000 r/min離心20 min，去除菌絲體，取5 mL上清液加入80%三氯乙酸溶液至終體積7%除蛋白，4 ℃靜置，8 000 r/min離心20 min，收集上清液，加入9 倍體積無水乙醇多次進行醇沉，離心得多糖沉淀，將多糖沉淀復溶于1 mL去離子水中，并用去離子水透析（截留分子質量10 kDa）24 h，每8 h換水一次，干燥即得粗多糖樣品[13-14]，含量測定用苯酚-硫酸法[15]。

1.3.4 抑菌實驗

根據Li Zhoukun等[16]的牛津杯法稍有改動：將指示真菌在PDA培養基上30 ℃培養2～4 d直至菌落直徑約為2 cm。然后將消毒的牛津杯放在菌落周邊培養基上，將所得干燥樣品復溶于無菌水中，取200 μL多糖提取物，使用等體積的無菌生理鹽水作為對照。將平板在30 ℃培養2～4 d，觀察真菌生長的抑制情況。通過菌落直徑的變化計算抑菌率。

細菌抑菌實驗根據Casaril等[17]單一微量稀釋法稍有改動：在96 孔板的每個孔中，加入100 μL含營養肉湯的細菌懸浮液（106CFU/mL），取100 μL上述發酵粗多糖提取液混合，陰性對照不加多糖提取液。在37 ℃孵育12 h后，用酶標儀測定波長600 nm處的吸光度，抑菌率通過比較吸光度測定。多糖對細菌生長的抑制率見下式：

式中：AB為只含細菌懸浮液的吸光度，作為不含多糖的陰性對照；AC為含有細菌懸浮液和粗多糖提取物溶液混合物的吸光度；AA為僅含有粗多糖提取物的吸光度。

1.3.5 尖孢鐮刀菌LD105多糖抑菌譜的測定

按照上述方法提取多糖用無菌生理鹽水配制成1 mg/mL溶液，過濾除菌，測定其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌、沙門菌、志賀氏菌、綠色木霉、水稻紋枯病菌和灰葡萄孢菌的抑菌活性，確定其抑菌譜。

1.3.6 尖孢鐮刀菌LD105固態發酵條件優化

1.3.6.1 單因素試驗

以固態發酵基礎培養基為起始培養基，分別考察基質種類（玉米粉、大豆粉、米糠、麥麩、玉米芯）；初始含水量（40%～90%）；營養條件：碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉：添加量1%～5%）、氮源（尿素、酵母膏、氯化銨、硫酸銨：添加量0.5%～2.5%）、無機鹽（KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、ZnSO4·7H2O：添加量0.1%～0.6%）；培養條件：發酵溫度（22～30 ℃）、初始pH值（5.5～7.5）、接種量（5%～30%）、發酵時間（2～10 d）對尖孢鐮刀菌LD105發酵產抑菌多糖的影響，根據單因素試驗結果和實際情況，選出對抑菌多糖影響的顯著因素進行響應面試驗設計。固態發酵優化過程均以大腸桿菌為指示菌，以多糖產量和抑菌率作為優化指標。

1.3.6.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果選擇對抑菌多糖有顯著影響的4 個因素：發酵時間、蔗糖添加量、初始含水量、KH2PO4添加量為自變量，以抑菌率和多糖產量為響應值，利用Design-Expert 8.0.5軟件進行4因素3水平的響應面試驗優化。

1.3.7 尖孢鐮刀菌LD105多糖分子質量測定

分子質量測定送由南京德祥同瑞生物科技有限公司采用凝膠排阻色譜法測定，多糖樣品采用以上方法處理。測定條件參考文獻[18]略有改動，以0.1 mmol/L NaNO3溶液作為流動相，流速0.7 mL/min，柱溫45 ℃，上樣質量濃度3 mg/mL，麥麩多糖作為對照處理。

1.4 數據處理與分析

所有實驗數據取3 次重復實驗的平均值，采用Origin 9.1作圖，響應面試驗設計通過Design-Expert 8.0.5軟件進行分析與處理，顯著性差異和相關性分析通過SPSS Statistics 17.0進行處理與分析，P＜0.05，表示差異顯著，P＜0.01，表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌菌株鑒定

由圖1a與1b所示，菌株LD105在PDA平板上生長7 d后菌絲由白色慢慢轉變為淺紫色，菌絲體致密呈絮狀，菌落突起。小型分生孢子著生于單生瓶梗上，頂端聚成球團，單胞，卵形，大型分生孢子無色、多胞、鐮刀形、略彎曲、兩端細胞稍尖[19]。該菌株通過28S rDNA序列進一步鑒定，序列已存入GenBank數據庫（登錄號：MG597030），序列分析表明菌株LD105與系統發育樹中尖孢鐮刀菌屬同源性最相近（圖1c）。由形態學觀察和分子生物學鑒定將菌株LD105歸類為尖孢鐮刀菌屬[20]。

圖1 尖孢鐮刀菌LD105菌株的菌落形態（a）、孢子形態（b）和28S rDNA序列構建的菌株LD105的系統發育樹（c）Fig.1 Colony morphology (a) and spore morphology (b) of strain LD105 and phylogenetic tree of strain LD105 constructed based on 28S rDNA sequence (c)

2.2 尖孢鐮刀菌LD105多糖抑菌譜

表1 尖孢鐮刀菌LD105多糖抑菌譜Table1 Antibacterial spectrum of the polysaccharide from F. oxysporum LD105

由表1可知，尖孢鐮刀菌固態發酵多糖對大多數細菌有抑制作用，而對綠色木霉、水稻紋枯病菌、灰葡萄孢菌等真菌基本無抑制作用。尖孢鐮刀菌LD105固態發酵所產多糖對大多數革蘭氏陰性菌有較強的抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制作用最強。因此實驗選用抑菌率最高的大腸桿菌作為指示菌。

2.3 尖孢鐮刀菌LD105固態發酵單因素試驗結果

2.3.1 基質種類對抑菌多糖的影響

由圖2可知，用玉米粉作固態發酵基質，多糖產量最高，為27.0 mg/g，抑菌率為12.7%，以麥麩作為發酵基質產生的抑菌多糖產量為19.0 mg/g，抑菌率為18.5%。實驗結果表明，選用玉米粉作為發酵基質產生的多糖產量最高，但抑菌效果不是最高，這主要是由于玉米粉本身含有大量淀粉，而固態發酵產生的抑菌多糖產量相對較少。用麥麩作發酵基質不僅可以提供一部分發酵所需的碳源和氮源，而且麥麩形成固態培養基后，組織狀態疏松、透氣性良好，有利于菌絲體的生長[21]，有利于抑菌多糖的產生。麥麩作為發酵基質相比于其他基質種類對抑菌多糖產量有顯著影響（P＜0.05），且麥麩價格低廉，因此實驗選用麥麩作為固態發酵的基質。

圖2 基質種類對抑菌多糖的影響Fig.2 Effect of different solid matrices on polysaccharide yield and antibacterial activity

2.3.2 初始含水量對抑菌多糖的影響

圖3 初始含水量對抑菌多糖的影響Fig.3 Effect of initial moisture content on polysaccharide yield and antibacterial activity

含水量在固態發酵中有很重要的作用[22]，由圖3可知，抑菌率隨著初始含水量的增加呈先上升后下降的趨勢，當初始含水量為50%時，菌體生長良好，這與Ali等[11]研究結果相似，在此條件下尖孢鐮刀菌LD105抑菌多糖產量為19.5 mg/g，抑菌率最高，達到21.6%，相比其他組分的含水量有顯著差異（P＜0.05），當初始含水量大于50%時，多糖產量和抑菌率均有所下降，且抑菌率下降較為顯著，表明初始含水量過高，不利于有效成分抑菌多糖的產生。這可能是因為含水量過高導致底物顆粒聚集，通氣不良[23]，影響抑菌多糖產生。所以初始含水量選擇50%最適宜。

2.3.3 營養條件對抑菌多糖的影響

圖4 營養條件對抑菌多糖的影響Fig.4 Effect of nutritional conditions on polysaccharide yield and antibacterial activity

碳源添加量被認為是發酵條件中微生物生長的關鍵因素[24]。由圖4A可知，碳源種類對菌體產多糖的抑菌效果依次為蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖＞淀粉，添加蔗糖為碳源時，多糖產量和抑菌率顯著增高（P＜0.05）。當蔗糖添加量增加到3%時多糖產量為26.3 mg/g，抑菌率為28.9%（圖4B），這與孫秋芳[25]的研究結果相似，以蔗糖為碳源，有利于多糖產量的提高。

由圖4C可知，KH2PO4為發酵最佳無機鹽種類，添加適量KH2PO4時，有助于抑菌多糖的產生，其最佳添加量為0.3%，在此條件下多糖產量為28.2 mg/g，抑菌率為32.7%（圖4D）。以往研究表明KH2PO4的適量添加有助于提高多糖產量，其中的磷元素參與糖代謝及能量代謝過程，鉀是許多酶的激活劑，可以促進碳水化合物的代謝，亦可提高細胞質膜的通透性，同時KH2PO4的添加可起到緩沖作用[26]。

2.3.4 發酵條件對抑菌多糖的影響

圖5 發酵條件對抑菌多糖的影響Fig.5 Effect of fermentation conditions on polysaccharide yield and antibacterial activity

由圖5A可知，尖孢鐮刀菌LD105生長的溫度范圍很廣，22～30 ℃均可以生長，由文獻[27]可知尖孢鐮刀菌的最適生長溫度為25 ℃。實驗中隨著溫度的升高，抑菌多糖產量呈現先增后降趨勢，這可能與菌絲體的生長有關[28]，可以看出，28 ℃是尖孢鐮刀菌固態發酵的最佳溫度，相比于文獻中的最適生長溫度高出3 ℃，可能是由于固態發酵基質結構疏松影響傳熱。當固態發酵溫度為28 ℃時，多糖產量和抑菌率達到最高為28.9 mg/g和32.2%，相比于其他發酵溫度影響顯著（P=0.045＜0.05）。

由圖5B可知，發酵時間對抑菌多糖有顯著影響（P＜0.05），抑菌多糖產量和抑菌率隨著發酵時間的延長呈先升高后下降的趨勢，發酵2 d時多糖產量基本保持不變，抑菌率略有增加，主要是由于起始的多糖主要來源于基質。到發酵4 d時菌體產生的多糖產量達到最高，為29.3 mg/g，抑菌率達33.1%。發酵4 d以后多糖產量和抑菌率呈下降趨勢。這可能是由于菌體大量繁殖，消耗了一部分所產生的多糖[29]。所以，發酵時間為4 d為宜。

對單因素試驗結果進行顯著性分析可知，氮源種類（P=0.1）與氮源添加量（P=0.82）、初始pH值（P=0.1）、接種量（P=0.6）對抑菌多糖影響不顯著（P＞0.05）。而對于發酵溫度來說雖然結果分析顯著（P=0.045＜0.05），但相比其他顯著（P＜0.01）的單因素對發酵的影響而言相對較弱，考慮到實際情況最終確定4 個對固態發酵有顯著影響的單因素：蔗糖添加量、發酵時間、初始含水量、KH2PO4。

2.4 尖孢鐮刀菌LD105固態發酵產抑菌多糖相關性分析

對實驗每個單因素的兩個評價指標抑菌率和多糖含量進行相關性分析，結果表明除基質種類（R=0.231；P=0.716＞0.05）其余單因素的抑菌率與多糖產量均呈正相關（P＜0.05），表明抑菌活性來源于產生的多糖。由上述單因素試驗結果分析可知，不同基質材料自身多糖含量各不同，提取的多糖存在基質本身含有的多糖，而這部分多糖并沒有抑菌活性，導致基質種類作為考察因素時，抑菌率與多糖產量之間不存在相關性。

2.5 尖孢鐮刀菌LD105固態發酵響應面試驗結果

將單因素試驗篩選出的4 個顯著性影響因素：蔗糖添加量（A）、發酵時間（B）、初始含水量（C）、KH2PO4（D）添加量為自變量，根據Box-Behnken設計方案進行試驗，利用Design-Expert 8.0.5軟件進行4因素3水平的響應面試驗優化，設定初始接種量10%、發酵溫度28 ℃、蛋白胨添加量1.5%、pH 6。各因素的試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Box-Behnken design with response variables

2.5.1 數學模型的建立結果

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2中的試驗結果進行回歸分析，數據進行二次多項回歸擬合，得到抑菌率（Y1）和多糖產量（Y2）對蔗糖添加量（A）、發酵時間（B）、初始含水量（C）、KH2PO4添加量（D）的二次多項式回歸方程：Y1=35.30+2.74A+8.14B+4.77C－2.29D+1.93AB－0.42AC+1.73AD－0.33BC+1.79BD+0.77CD－6.27A2－12.66B2－5.95C2－2.87D2；Y2=29.62+1.10A+2.63B+1.96C－0.74D+0.61AB－0.21AC+0.68AD+0.039BC+0.099BD+0.26CD－2.72A2－4.41B2－2.21C2－1.00D2。

表3 抑菌率回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance of quadratic regression model for antibacterial activity

表4 多糖產量回歸模型方差分析Table4 Analysis of variance of quadratic regression model for polysaccharide yield

由表3、4可知，該模型回歸極顯著，抑菌率和多糖產量的F值分別為68.55和83.71，失擬項差異不顯著，抑菌率和多糖產量的P值分別為0.13（P＞0.05）和0.88（P＞0.05），說明該模型選擇合適，對優化尖孢鐮刀菌固態發酵工藝有實際應用意義。同時，模型可信度分析相關系數R2=0.98和=0.97很接近于1，說明該模型相關度很好[30]，可以很好地反映試驗真實值，操作可信。綜上所述模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠反映響應值的變化，可以準確地分析預測尖孢鐮刀菌LD105多糖產量和抑菌率。

由回歸模型系數顯著性檢驗結果可知：兩模型的一次項A、B、C、D影響極顯著（P＜0.01），二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AD影響顯著（P＜0.05），表明蔗糖添加量和KH2PO4添加量以及發酵時間和KH2PO4添加量對抑菌率和多糖產量均有交互影響的作用。在抑菌率方面，KH2PO4添加量和發酵時間之間（BD）也存在顯著交互影響的作用。

2.5.2 尖孢鐮刀菌LD105響應面分析

圖6 各因素交互作用對多糖產量和抑菌率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects among various factors on response variables

由圖6a和6c可知，在KH2PO4添加量不變的條件下，隨著發酵時間的逐漸延長，抑菌率呈現迅速上升、達到峰值平緩下降的趨勢。由圖6a和6b可知，在發酵時間不變的條件下，隨著蔗糖添加量的逐漸增加，抑菌效果變化明顯。當蔗糖添加量3%、發酵時間4 d、KH2PO4添加量0.3%時，多糖產量和抑菌率均達到峰值。由圖6c、d可知，在KH2PO4添加量不變的條件下，隨著發酵時間的延長，抑菌性呈現先上升后下降的趨勢，而多糖產量并沒有顯著變化，這有可能是抑菌多糖與無功能多糖之間比例有所變化，但總量并沒有顯著變化。

根據響應面軟件分析結果可知最優工藝條件：發酵時間5 d、蔗糖添加量3.2%、初始含水量53.8%、KH2PO4添加量0.28%、蛋白胨添加量1.5%、初始pH 6、接種量10%、發酵溫度28 ℃，在該優化條件下，抑菌率和多糖產量的理論值分別為38.0%和30.5 mg/g。

為驗證該模型對抑菌率預測的準確性，并考慮到實際操作的方便性，將得到的最佳工藝條件定為發酵時間5 d、蔗糖添加量3%、初始含水量54%、KH2PO4添加量0.3%、蛋白胨添加量1.5%、初始pH 6、接種量10%、發酵溫度28 ℃，在此條件下進行3 次重復實驗，結果表明，抑菌率和多糖產量平均值為37.6%和30.2 mg/g，與預測值接近，說明模型準確有效。尖孢鐮刀菌在最佳發酵條件下生長狀態良好，發酵過程穩定。

2.6 尖孢鐮刀菌LD105多糖分子質量測定結果

尖孢鐮刀菌固態發酵多糖重均分子質量為154 kDa，數均分子質量為29 kDa，分散系數為5.4，結果出現2 個峰值，小峰相比較主峰峰面積來說，占2%的比例，含量較少。未發酵的麥麩多糖主峰明顯，含量高，多糖重均分子質量為14 kDa，數均分子質量為14 kDa，分散系數為2.8，可知麥麩多糖峰值分布相對尖銳。由實驗結果可知，固態發酵的尖孢鐮刀菌多糖相比麥麩多糖重均分子質量不同，尖孢鐮刀菌固態發酵多糖分子質量更大，推測可能是尖孢鐮刀菌利用固態基質產生了大分子質量的多糖。

3 結 論

本實驗以一株產抑菌多糖的尖孢鐮刀菌LD105為發酵菌種，其固態發酵多糖對革蘭氏陰性菌有較好的抑菌效果，尤其是對大腸桿菌抑菌效果最好。該多糖的抑菌特性使其在新型綠色農藥和飼料添加劑方面有著良好的應用前景。本實驗采用雙評價指標，通過單因素試驗和響應面設計進一步優化尖孢鐮刀菌LD105產抑菌多糖的能力，優化結果明顯，抑菌率和多糖產量顯著增加（P＜0.05）。通過本實驗可知，與以往先提升產量后測活性的方法相比，以功能活性為檢測目標篩選產功能性多糖的菌株將更直接有效，目的性也更強，為將來篩選產功能性化合物的菌株，以及提高目標產物的產量提供一種科學有效的實驗方法。