優良梨汁發酵乳酸菌的篩選與發酵性能分析

焦媛媛，杜麗平，孫 文，魏金艷，馬立娟，肖冬光

（天津科技大學生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

乳酸菌發酵食品的歷史由來已久，近幾年關于乳酸菌發酵水果或蔬菜飲料的研究逐漸增多，經過乳酸菌發酵不僅提高果蔬本身營養價值，延長保鮮時間、增加保健作用，還可以改善風味[1-4]。乳酸菌發酵產生乳酸及其他有機酸，這賦予了發酵底物豐富的口感和營養功效。揮發性風味物質是影響果蔬飲料質量的重要因素，風味物質主要來源于原料本身和乳酸菌發酵后產生的代謝產物，良好獨特的風味使發酵食品更容易被接受[5-7]。Filannino等[8]選用植物乳桿菌接種有機石榴汁，開發出一款風味和健康功效俱佳的發酵石榴汁產品。張亞雄等[9]采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種進行單一果蔬汁及復合果蔬汁發酵。鄒玉紅等[10]以保加利亞乳酸桿菌和嗜熱酸鏈球菌混菌比例1∶1發酵蘋果、胡蘿卜混合果汁，并對發酵飲料的生產工藝進行了研究。劉磊等[7]利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌對龍眼發酵，結果顯示乳酸菌發酵可顯著增加龍眼果漿的總酸及揮發性風味物質，利于開發風味獨特的龍眼乳酸菌飲料新產品。Yoon等[11]采用4 種乳酸菌混合發酵西紅柿汁，經過72 h發酵后其pH值下降至4.1，酸度增加了0.65%。

梨含有豐富的糖、有機酸和多種維生素、鈣、鐵、錳、鋅、氨基酸等，具有生津止渴、潤燥化痰、潤腸通便、降低血壓、養陰清熱、促進食欲、幫助消化等功效[12-13]。如今國內市場上，用于梨或其他水果發酵的菌種均以引進自國外的一些商業乳酸菌為主，對發酵材料和發酵環境的適用性差，生產的梨汁等水果發酵飲品質量參差不齊。影響發酵質量的因素包括原材料、發酵菌種、發酵條件、產品風味等，因此，選擇能適應發酵條件且風味優良的菌種尤為關鍵[14-15]。本實驗對分離自水果發酵液和其他不同來源的10 株乳酸菌進行研究，從中篩選出適應梨汁發酵條件的乳酸菌作為發酵菌株，并通過純種發酵對發酵過程中活菌數、pH值、有機酸和揮發性成分進行檢測，進一步優選出性能優良的乳酸菌作為梨汁的發酵菌株，這不僅為開發新的梨汁發酵產品提供了可能，同時也豐富了水果發酵專用菌種庫。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

新鮮水晶梨 市購；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZG1，分離自酸菜發酵液；植物乳桿菌ZG2，分離自蘋果、梨混合發酵液；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）BGG1，分離自蘋果、梨混合發酵液；副干酪乳桿菌BGG2，分離自雪蓮菌；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）GG2，分離自雪蓮菌；干酪乳桿菌GG8，分離自白酒酒糟；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）WQ1，分離自梨、香蕉混合發酵液；戊糖片球菌WQ2，分離自木瓜發酵液；魏斯氏菌（Weissella）WS，分離自梨、香蕉混合發酵液；檸檬明串珠球菌（Leuconostoc citreum）NQ，分離自雪蓮菌。菌株均由天津科技大學現代釀造實驗室保藏。

MRS液體培養基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，硫酸錳0.25 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值調整到6.2，115 ℃濕熱滅菌20 min。

生理鹽水：準確稱量1.8 g NaCl固體，溶解于200 mL去離子水。

5 mmol/L硫酸：準確量取0.244 mL濃硫酸，加入1 L去離子水，混勻后通過0.45 μm水膜過濾。

1.2 儀器與設備

擠壓式榨汁機 荷蘭飛利浦單子有限公司；UV2800紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Centrifuge 5430R離心機 德國艾本德有限公司；2XJD-A1270型培養箱 鄭州南北儀器設備有限公司；1200高效液相色譜儀、GC7890/MS5975氣相色譜-質譜儀美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線測定[16]

將活化好的10 株實驗乳酸菌株按2%接種量分別接入滅菌的MRS液體培養基，37 ℃靜置培養24 h，從0 h開始每隔2 h取樣，以未接種的MRS液體培養基作為空白對照，測定樣品在600 nm波長處的OD值，每個樣品重復測定3 次，根據時間和OD600nm值繪制各菌株的生長曲線。

1.3.2 耐受性實驗

將活化好的10 株實驗乳酸菌株按2%接種量分別接種于正常的和不同糖度（15、20 °Bx和25 °Bx）、不同pH值（pH 3.0、pH 3.5和pH 4.0）或不同乳酸質量濃度（4、6、8 g/L和10 g/L）的MRS液體培養基中，置于恒溫培養箱中37 ℃靜置培養24～36 h后取樣，觀察菌株生長情況，以未接種的不同糖度、不同pH值或不同乳酸含量的MRS液體培養基作為空白對照，測定樣品在600 nm波長處的OD值，每個樣品重復測定3 次。將接入正常MRS液體培養基中各菌株的OD600nm值作為標準，比較各菌株在不同條件下的OD600nm值，優選出耐受性較好的菌株[17-18]。

1.3.3 梨汁發酵實驗

將購買的新鮮水晶梨經鹽水浸泡后清洗，并于無菌條件下進行榨汁，加入冰片糖調節梨汁糖度為20 °Bx后分裝于無菌錐形瓶中密封，經巴氏滅菌后4 ℃冷藏[19]。取活化后的乳酸菌液（GG8和ZG2菌濃度分別為4.36×108CFU/mL和5.12×108CFU/mL），6 000 r/min離心10 min，棄上清液，生理鹽水重復清洗2 次。按照10%的比例將2 株乳酸菌分別接種于梨汁中，30 ℃條件下發酵144 h，每24 h取樣待測[20]。

1.3.4 活菌數、pH值的測定

乳酸菌計數采用平板稀釋法[21]。pH值用pH計直接測定。

1.3.5 有機酸的測定

采用紫外高效液相色譜法測定有機酸含量，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流動相為5 mmol/L H2SO4溶液；流速0.6 mL/min；柱溫60 ℃；紫外檢測器；波長210 nm；進樣量20 μL。每個待測樣品重復3 次[22]。

1.3.6 揮發性成分測定

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜方法測定與分析樣液中揮發性物質。取8 mL發酵液樣品置于20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，60 ℃水浴加熱，平衡10 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭靜態吸附50 min，熱解吸5 min。氣相色譜分離條件為：色譜柱HP-5；載氣He；流量1.0 mL/min；分流進樣，分流比20∶1；升溫程序：初始45 ℃（保留2 min），3.5 ℃/min升至220 ℃（保留2 min）。質譜檢測條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，電壓 70 eV，發射電流34.6 μA；界面溫度280 ℃；掃描質量范圍30～550 u。每個待測樣品重復3 次[13,23]。

1.4 數據分析

生長曲線及活菌數、pH值的結果使用Origin Pro 8.0進行處理與分析。有機酸測定結果依據已有標樣的出峰時間和標準曲線進行處理與分析。揮發性成分利用質譜全離子掃描圖譜和NIST05標準譜庫比對結果進行定性分析，采用氣相色譜峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 不同乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of different strains of lactic acid bacteria

如圖1所示，菌株ZG1、ZG2、GG2生長速度較快，延滯期不明顯，很快進入對數期，并在發酵10 h后進入穩定期；菌株GG8、BGG1、BGG2、WQ1和WQ2具有明顯的延滯期、對數期和穩定期，在發酵2～4 h后進入對數期；菌株WS生長速度較慢，對數生長期短，且菌體數量較低；菌株NQ生長速度最慢，各生長期均不明顯，菌體數量無明顯變化。因此，菌株ZG1、ZG2、GG2、GG8、BGG1、BGG2、WQ1和WQ2生長性能良好，可對其耐受性能進一步研究。

2.2 乳酸菌耐受性篩選

梨汁發酵過程中，適當的糖含量可以促進發酵的進行，改善發酵液的口感。其次，乳酸菌在發酵代謝過程中會產生乳酸及其他有機酸，乳酸作為主要代謝產物，在發酵初期含量會迅速增加，導致發酵液pH值迅速下降[17-18]，從而抑制乳酸菌生長。因此，較好的耐受特性有助于乳酸菌的發酵。根據菌株耐受性分析結果（表1）可知，10 株乳酸菌的生長情況在不同糖度、不同pH值和不同乳酸含量條件下會不同程度受到影響。菌株ZG1、ZG2、GG2、GG8、WQ2和NQ均具有相對較好的耐糖特性，滿足發酵要求；菌株ZG2、GG2和GG8在pH 3.0～4.0條件下生長良好或受抑制程度不明顯，說明具有較好的耐酸性；菌株GG8的耐乳酸特性最好，其次為菌株ZG2。綜合菌株的耐受性，選擇耐受性均較好的菌株GG8和菌株ZG2作為發酵菌株，對其發酵性能進一步研究[24-25]。

表1 不同乳酸菌的耐受性分析Table1 Tolerance of lactic acid bacterial stains to stress conditions

2.3 發酵液中活菌數與pH值變化

將通過篩選得到的干酪乳桿菌GG8和植物乳桿菌ZG2作為發酵菌株，接入梨汁中發酵，對發酵液中活菌數測定，結果見圖2。干酪乳桿菌GG8在發酵24 h時活菌數增加，且在120 h內活菌數始終在106CFU/mL以上，之后活菌數迅速下降；植物乳桿菌ZG2在發酵液中活性相對較弱，發酵24 h時活菌數增加，之后開始明顯下降，至發酵結束時降到105CFU/mL以下。發酵液中pH值降低不僅能夠影響一些不耐酸的微生物生長繁殖，同時也賦予了柔和的酸味[26]。如圖3所示，2 株菌在發酵過程中pH值的下降趨勢相似，發酵前期pH值迅速下降，這與發酵前期乳酸菌的大量增殖有關；發酵后期，由于代謝產物、pH值等因素抑制，乳酸菌進入衰亡期，活菌數下降，pH值趨于穩定[27]。相較植物乳桿菌ZG2，干酪乳桿菌GG8在梨汁發酵液中生長情況較好，受條件抑制影響較小。

圖2 2 株乳酸菌純種發酵梨汁中活菌數變化Fig.2 Changes in viable count in pear juice fermented by 2 strains of lactic acid bacteria

圖3 2 株乳酸菌純種發酵梨汁的pH值變化Fig.3 Changes in pH value in pear juice fermented by 2 strains of lactic acid bacteria

2.4 發酵液中有機酸含量變化

有機酸可以幫助人體完成新陳代謝的過程，修復人體病變器官等[22,28]。由圖4可知，梨汁原液中主要含有甲酸和蘋果酸，以及微量琥珀酸。2 株乳酸菌發酵144 h后，發酵液中有機酸種類相似，干酪乳桿菌GG8發酵液總酸含量高于植物乳桿菌ZG2。經干酪乳桿菌GG8發酵24 h，甲酸、蘋果酸及琥珀酸等均迅速減少，乳酸和檸檬酸增加明顯，乙酸少量增加；經植物乳桿菌ZG2發酵24 h，甲酸、蘋果酸及琥珀酸等也迅速減少，乳酸含量增加，且高于干酪乳桿菌GG8發酵液，乙酸和檸檬酸含量僅少量增加。因此，植物乳桿菌ZG2產乳酸的能力明顯高于干酪乳桿菌GG8，產檸檬酸能力弱于干酪乳桿菌GG8。

圖4 干酪乳桿菌GG8（A）和植物乳桿菌ZG2（B）產有機酸情況Fig.4 Organic acid production rates of L. casei GG8 (A) and L. plantarum ZG2 (B)

2.5 發酵液中揮發性風味物質分析

發酵梨汁的風味物質主要來源于原料本身和乳酸菌發酵后產生的代謝產物[29]。根據表2可知，發酵前后共檢測到26 種揮發性成分，其中醇類最多，為9 種，醛酮類6 種，酯類和酸類分別為3、2 種。發酵前后，構成梨汁主體風味的物質主要包括2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇和松油醇。

梨汁原液中主體風味物質有正己醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇、正辛酸、3,5-二甲基苯甲醛、大馬士酮和香葉基丙酮等。干酪乳桿菌GG8發酵72 h后，共檢測到15種揮發性成分，其中構成主體風味的有正己醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇、正辛酸、3,5-二甲基苯甲醛、橙花醇、大馬士酮，以及通過發酵新產生的己酸乙酯和癸酸乙酯，賦予發酵液特殊的酒香；至發酵144 h時，揮發性風味物質部分消失，保留了2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇和3,5-二甲基苯甲醛4種主要成分的同時，新生成了L-（－）-二苯甲酰酒石酸、反式-2,4-癸二烯醛、合金歡醇和棕櫚酸乙酯，這使得發酵后期梨汁風味更加復雜、獨特。植物乳桿菌ZG2發酵72 h，共檢測到17種揮發性成分，主要揮發性風味物質同梨汁原液類似，主要包括正己醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇、正辛酸、3,5-二甲基苯甲醛和香葉基丙酮等，發酵新形成了具有特色風味的己醛、苯乙醇和反式-2,4-癸二烯醛；發酵144 h時，大量揮發性風味物質消失，保留了3種主要的風味物質[30-31]。較植物乳桿菌ZG2發酵梨汁，干酪乳桿菌GG8發酵梨汁含有相對豐富的揮發性風味物質，風味獨特。

表2 2 種乳酸菌發酵梨汁中、后期的主要揮發性物質相對含量比較Table2 Relative contents of volatile substances in pear juice fermented with lactic acid bacteria during the middle and late stages of fermentation

3 結 論

通過研究10 株分離于水果發酵液及其他不同來源乳酸菌的耐糖、酸及耐乳酸等特性，篩選出2 株適宜梨汁發酵的乳酸菌，分別為干酪乳桿菌GG8和植物乳桿菌ZG2。通過對2 株菌的生長情況、發酵特性及代謝產物研究后發現，干酪乳桿菌GG8起酵快，發酵時間長，不易受環境抑制影響，產酸多，且能夠產生較為豐富的揮發性物質；植物乳桿菌ZG2產乳酸能力強。綜合考慮菌株的各項性能，選擇干酪乳桿菌GG8作為梨汁發酵的優選菌株具有很大潛力和價值，可對其性能及在梨汁發酵工藝中的應用進一步研究驗證。