PlnF抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表達及抑菌活性鑒定

任大勇，朱劍威，劉宏妍，于寒松，沈明浩

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

金黃色葡萄球菌是一類革蘭氏陽性致病菌株，屬于葡萄球菌屬，易于污染魚、肉、乳制品等食品從而引發腸炎，肺炎等食源性疾病[1-2]。此外，由于金黃色葡萄球菌的耐藥菌株對絕大數抗生素都具有明顯的耐藥性[3]，這導致感染而造成的死亡事件呈現逐年上升的趨勢，所以開發天然的具有抑菌金黃色葡萄球菌的物質便成為了研究的熱點。

乳酸菌作為一種益生菌，因分泌通常認為無害且具有廣譜抑菌效果的多肽而被廣泛研究。在2011年乳酸乳球菌被我國原衛生部納入《可食用的菌種名單》，且乳酸乳球菌符合美國食品和藥物管理局的食用標準[4]。其中乳酸乳球菌表達載體pNZ8149/NZ3900是由Nisin誘導的食品級的表達載體。NZ3900菌株是一類乳糖缺陷型菌株，而質粒pNZ8149攜帶乳糖分解酶基因，當NZ8149正確轉入NZ3900菌株后，使菌株代謝乳糖產生乳酸，pH值的下降使溴甲酚紫培養基由紫色變黃色后從而進行篩選。

本課題組在前期的實驗中，從東北家庭自制的辣醬、臭豆腐、黏面子等發酵食品中通過傳統抑菌實驗和基因測序發現了多株含有plnF、plnE、plnN、plnJ等抗菌肽基因且具有抑菌效果的乳酸菌[5-7]，并進一步將抗菌肽基因在pET28a/BL21（DE3）載體進行表達，表達產物對金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌有較好的抑制效果。其中只有plnF表達產物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，但是由于plnF基因在pET28a等大腸表達載體中表達后，需要經過復雜的變復性和純化處理才能被應用，所以本實驗試圖在usp45信號肽作用下[8]，將plnF基因與pNZ8149質粒結合，轉入NZ3900乳酸乳球菌表達載體[9]，為抗菌肽在乳酸乳球菌表達載體中的胞外分泌提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Pfu酶 北京天根生化科技有限公司；Ex Taq酶、dNTP、DL500 DNA Marker、DL2000 NDA Marker、DL15000 DNA Marker 大連寶生物工程有限公司；NcoI、SphI、SacI限制性內切酶，T4 DNA連接酶 NEB（北京）公司；膠回收試劑盒 美國Omega公司；質粒提取試劑盒 美國Aeygen公司；瓊脂糖 法國Biowest公司；M17肉湯培養基、MRS肉湯 青島海博生物技術有限公司；三羥甲基甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、溴甲酚紫、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂、甘油 北京化工廠。

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538p） 中國工業微生物菌種保藏管理中心；pNZ8149菌株、NZ3900菌株、植物乳桿菌（T4、T8）、pMG36e-S-cbhII由吉林農業大學食品科學與工程學院食品毒理與安全實驗室保存。

GM17培養基：M17培養基、5 g/L葡萄糖；SGM17培養基：M17培養基、0.5 mol/L蔗糖、25 g/L甘氨酸、5 g/L葡萄糖；GM17MC恢復培養基：M17培養基、5 g/L葡萄糖、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2；pNZ8149篩選培養基：M17培養基、0.04 g/L溴甲酚紫、瓊脂；溶液I：0.5 mol/L蔗糖+100 mL/L甘油；溶液II：0.5 mol/L蔗糖+100 mL/L甘油+0.05 mol/L EDTA。

1.2 儀器與設備

GeneAmp 9700基因聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國ABI公司；垂直電泳槽、水平電泳槽、DYY-11型電泳儀 北京六一儀器廠；ECM399型電轉化儀 美國BTX公司；JY92-II型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Biotop SC810凝膠成像系統 上海山富科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株信息與活化

－80 ℃保存的植物乳桿菌T4、T8分別按照1%接種量接種于MRS肉湯培養基，37 ℃靜置厭氧培養，金黃色葡萄球菌接種于LB培養基中，37 ℃、200 r/min活化備用；NZ3900、pMG36e-S-cbhII、pNZ8149菌株接種于M17培養基中，30 ℃厭氧條件下復蘇培養后備用。

1.3.2 抗菌肽基因PCR擴增

根據NCBI中PlnF抗菌肽基因序列，為與pNZ8149質粒相連接，以T4和T8菌株為模板，PlnF上游引物添加SphI酶切位點（5’-ATAAAAGCATGCAAAAAATTTCT AGTTTTGCGTGAC-3’），下游引物添加SacI酶切位點（5’-ATAAAAGAGCTCCTATCCGTGGATGAATCCTCG GACAGC-3’）進行PCR擴增。按照如下程序進行：95 ℃預變性2 min；35 個循環（95 ℃變性30 s；65 ℃退火45 s；68 ℃延伸90 s）。在2%瓊脂糖中進行電泳驗證并進行DNA純化后在－20 ℃保存。此外，以含有usp45信號肽基因的pMG36e-S-cbhII為模板，在P1和P2引物[10]上下游分別添加NcoI和SphI酶切位點等后進行PCR擴增信號肽基因。

1.3.3 感受態制備

NZ3900感受態參考Holo等[11]的方法，略作修改。第1天挑取NZ3900單菌落接種于5 mL GM17中，30 ℃厭氧培育12 h，待12 h后，在10 mL SGM17中轉接入500 μL已活化12 h的菌液，30 ℃培養12 h。將10 mL培養液整體加至100 mL SGM17培養液中，30 ℃培育4 h后冰浴20 min，5 000 r/min離心10 min后棄上清液。滅菌預冷的40 mL溶液I重懸菌體，冰上靜置20 min離心棄上清液，25 mL預冷溶液II重懸菌體冰上靜置后離心取菌體。再用15 mL溶液I重懸菌體，冰上靜置20 min后離心棄上清液。最后加入1 mL溶液I重懸菌體，80 μL分裝，置于－80 ℃保存。

1.3.4 重組質粒的構建與驗證

乳酸乳球菌表達載體構建如圖1所示，提取的pNZ8149質粒[12-13]與plnF基因在SphI和SacI限制性內切酶作用雙酶切并進行回收后，按照20 μL反應體系（0.5 μL的T4 DNA連接酶，2 μL的10×T4 DNA Buffer，載體與PCR片段按照不同比例添加）在16 ℃過夜連接，與80 μL的NZ3900感受態混勻后在電阻200 Ω、電容25 μF、電場強度10 kV/cm條件下[14]進行電轉化，并將轉化后復蘇的菌液涂布于篩選培養基上，靜置培養24 h。進一步挑取平板上黃色生長的菌株活化[15-16]并進行菌落PCR和雙酶切驗證，并將其送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI中進行比對。進一步將usp45信號肽基因按照如上步驟與重組質粒進行結合。

圖1 重組表達載體的構建流程圖Fig.1 Flow chart for the construction of recombinant expression vector

1.3.5 PlnF蛋白的誘導表達與抑菌活力的測定

將pNZ8149-usp45-plnF乳酸乳球菌陽性轉化子進一步純化后，接種于M17培養基中，過夜培養后再次接種于新鮮的5 mL GM17培養基中，待OD600nm至0.4左右后，加入終質量濃度為1 ng/mL的Nisin分別誘導表達3、4、5、6 h。12 000 r/min離心3 min[17]，取上清液和菌體，以超低溫反復凍融和超聲破碎提取胞內蛋白，并經一定的透析濃縮處理后，采用牛津杯擴散法[18]測定上清液和胞內蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。進一步使用Tricine-SDS-PAGE和納升液相色譜-電噴霧-串聯質譜（nano liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry，nano LC-ESI-MS/MS）對PlnF蛋白進行分析。

1.4 數據處理和圖像處理

抑菌實驗均重復進行3 次，以SPSS軟件對抑菌圈大小進行數據分析；DNA凝膠電泳結果均在biotop凝膠成像系統上采集。

2 結果與分析

2.1 plnF基因的擴增

圖2 PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results

由圖2可知，以植物乳桿菌T4和T8為模板對plnF基因進行PCR擴增后，在150～200 bp之間出現明顯的單一條帶；此外，為使ups45信號肽基因插入pNZ8149中起到胞外分泌的作用，在引物上下游添加NcoI和SphI酶切位點和保護性堿基之后，進行PCR擴增發現在100 bp上方出現了與預期一致的條帶，將條帶送去測序并比對后證明目標條帶分別與plnF和usp45信號肽基因具有100%的相似度，表明PCR擴增過程中目標基因沒有突變。

2.2 乳酸乳球菌陽性轉化子的驗證

圖3 乳酸乳球菌陽性轉化子驗證Fig.3 Validation of Lactococcus lactis-positive transformants

由于NZ3900感受態是乳糖缺陷型菌株，而質粒pNZ8149攜帶乳糖分解酶基因，所以當重組質粒正確轉入NZ3900感受態后，菌落周圍會在平板上呈現為黃色。挑選黃色的陽性轉化子為模板進行PCR擴增如圖3A所示，3號陽性轉化子在150 bp附近出現了與預期一致的條帶，經進一步的測序比對驗證pNZ8149-plnF重組質粒構建成功。進一步將usp45信號肽基因與pNZ8149-plnF質粒進行重組，經PCR擴增、雙酶切驗證（圖3B、3C）、測序和顯色篩選驗證表明，pNZ8149-usp45-plnF乳酸乳球菌重組質粒成功，將驗證正確的乳酸乳球菌陽性轉化子甘油保存于－80 ℃備用。

2.3 重組乳酸乳球菌工程菌抑菌活力的鑒定

在NZ3900/pNZ8149的乳酸菌表達體系中，低劑量的Nisin可以有效誘導目標蛋白的表達，所以以終質量濃度1 ng/mL的Nisin對工程菌分別誘導3、4、5、6 h后通過牛津杯擴散法對金黃色葡萄球菌抑菌效果測定。在圖4中，與空載體對比可知，僅誘導3 h的工程菌上清液中目的蛋白表達量較少，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不顯著，僅在9 mm左右，隨著Nisin誘導時間的延長，工程菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果逐漸增強，當誘導5 h時上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈增至（13.73±0.15）mm，誘導6 h的上清液抑菌圈為（14.03±0.23）mm。并且從誘導4 h開始，工程菌胞內蛋白對于致病菌也逐漸具有了一定的抑菌效果，這表明在乳酸乳球菌表達載體中起胞外表達的usp45信號肽被正確識別，目的蛋白主要以胞外可溶形式存在，且部分蛋白可能由于表達過多而積累在胞內。一系列結果表明，Nisin誘導的NZ3900/pNZ8149-usp45-plnF表達載體，誘導時間對于蛋白的表達量有影響[19]。選取具有抑菌效果的6 h的表達蛋白進行的Tricine-SDS-PAGE和nano LC-ESI-MS/MS分析。

圖4 表達蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌圖Fig.4 Antimicrobial activity of the expressed protein against Staphylococcus aureus

2.4 重組質粒的Tricine-SDS-PAGE和nano LC-ESI-MS/MS分析

由抑菌實驗可知，誘導表達6 h工程菌上清液和胞內蛋白對金黃色葡萄球菌都具有一定的抑菌效果，所以分別取兩者進行Tricine-SDS-PAGE后，如圖5所示，以pNZ8149/NZ3900為對照，工程菌上清液在5.8～7.8 kDa附近出現一條與預期5.9 kDa相近的條帶。進一步通過nano LC-ESI-MS/MS分析，結果于uniprot數據庫比對結果后制作如圖6所示系統樹[20]，目的片段與PlnF抗菌肽（編號F9UU07）具有97.6%的同源性，表明工程菌以胞外表達形式正確表達了PlnF蛋白。

圖5 pNZ8149-PlnF的Tricine-SDS-PAGE圖Fig.5 The Tricine-SDS-PAGE of pNZ8149-PlnF

圖6 目標蛋白的系統進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the target protein

3 討 論

有研究發現，抗生素反復刺激使大腸桿菌在自身質粒中通過基因重組的方式整合了cfr耐藥基因，從而形成耐藥性的“超級細菌”，在臨床上也有越來越多的耐藥性葡萄菌屬致病菌被發現[21-22]，而現有的臨床抗生素對這些耐藥菌株的治療效果越來越小，嚴重危害了人身健康，迫切需要研究開發一些安全、天然、有效抑制耐藥性菌株生長的抗菌劑。抗菌肽是由20～60 個氨基酸殘基構成的小于10 kDa的低分子質量、具有熱穩定的多肽，從昆蟲、植物、哺乳動物、微生物等天然途徑提取，主要通過直接破壞微生物的膜結構從而對革蘭氏陰性菌和陽性菌起到抑制生長的作用[23-24]，被公認為是一類潛在的可以替代抗生素的制劑。由于抗菌肽具有選擇性抑菌的特性，所以需要篩選合適的抗菌肽應用于不同適應癥。例如，Joseph等[25]從篩選出的短鏈抗菌肽DASamP1在體外抑菌實驗中可有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300；以及表達的植物細菌素Pln1[26]對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌等革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌效果。但是抗菌肽在天然產物中含量較少，提取較為復雜，以及低產量也限制了抗菌肽的應用，所以期望以基因工程技術來大量獲得抗菌肽。

本課題組前期從多種家庭自制發酵食品中篩選出多株具有抑菌效果的乳酸菌，發現有7 株菌抑制金黃色葡萄球菌效果較好。根據GenBank中乳酸菌抗菌肽基因設計合成了5 對引物，用大腸桿菌表達系統對這些基因進行克隆與表達從而驗證哪一種抗菌肽對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。實驗結果表明PlnF對金黃色葡萄球菌抑制效果最好。相較于大腸桿菌表達載體克隆表達的蛋白處理復雜和畢赤酵母的長時間培育[27-28]，乳酸乳球菌具有培養時間短，且表達產物可直接應用于食品之中等優點[29-30]，為后續開發應用提供了便捷。

本研究采用乳酸乳球菌Nisin誘導基因表達系統pNZ8149/NZ3900，首先從植物乳桿菌T4、T8中擴增plnF基因，進一步添加usp45信號肽基因以構建胞外分泌的重組質粒pNZ8149-usp45-plnF。構建成功的重組菌經1 ng/mL Nisin分別誘導3、4、5、6 h，結果表明，在3～4 h的誘導時間里，上清液對金黃色葡萄球菌抑菌效果逐漸增加，誘導至5 h后，上清液抑菌效果增加速率逐漸減緩，誘導6 h的上清液對金黃色葡萄球菌具有（14.03±0.23）mm的抑菌圈。而在構建重組質粒過程中，重組質粒對電轉化效率影響較大，所以在提取pNZ8149質粒和目的基因的過程中應將其濃縮，以減少電轉化時濃度不足的影響。本實驗通過Nisin誘導的食品級分泌表達載體克隆表達的PlnF抗菌肽對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，為開發新型的天然來源的抗菌劑提供了一定基礎。