槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成

葉發銀，呂 霞，李金鳳，王勇德，趙國華,3,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065；3.重慶市甘薯工程技術研究中心，重慶 400715）

作為食品配料，淀粉在食品中用途廣泛。隨著食品工業對食品配料性能要求的不斷提高，原淀粉的有些性質已不能滿足要求。通常采用物理法、化學法或酶法改造原淀粉得到變性淀粉，以滿足食品加工所需功能性質[1]。其中，化學改性是增加或提高淀粉功能性質的有效方法，全球約80%的變性淀粉采用化學法生產[2]。相比原淀粉，變性淀粉具有更優良的性質，如黏度低且穩定、凝沉性弱、成膜性好、溶解性或透明度更高[3]。有些變性淀粉可用作營養物或食品功能因子靶向輸送載體，在功能食品領域具有巨大的應用潛力[4-5]。通過化學改性調控淀粉消化特性的研究也非?；钴S。Han等[6]發現蠟質玉米淀粉經交聯-羥丙基化處理可獲得慢消化淀粉含量高（21%）的產品，經交聯-乙酰化處理可獲得抗消化淀粉含量高（24%）的產品，經辛烯基琥珀酸酐處理則可以同時提高產品中慢消化淀粉和抗消化淀粉含量。He Jinhua等[7]認為辛烯基琥珀酸酐改性最適合用來制備慢消化淀粉（28.3%），原因在于辛烯基琥珀酸基團對淀粉酶有非競爭性抑制作用，影響淀粉酶對淀粉催化水解。Carlos-Amaya等[8]研究了化學改性香蕉淀粉對其消化性的影響，結果表明，單獨酯化或交聯處理可顯著增加慢消化淀粉含量，采用酯化-交聯處理則可以顯著增加抗消化淀粉含量。Shah等[9]研究發現燕麥淀粉經乙酰化改性后，其抗消化淀粉的含量可提高2 倍。

近年來，具有生物活性的變性淀粉開發引起了國內外學者的興趣。研究發現，淀粉硫酸酯[10]和雙醛淀粉[11]具有較好的自由基清除能力。Mathew[12]和Wen Yu[13]等分別將阿魏酸共價結合到馬鈴薯淀粉及玉米淀粉上，均得到具有抗氧化活性的產物。Tan Wenqiang等[14]通過多步反應得到具有良好抑菌活性的三氮唑淀粉衍生物。

槲皮素是果蔬食品原料中常見的黃酮類物質，具有多種有益的生理及藥理活性[15]。研究發現，將槲皮素共價結合到一些高分子材料上，一方面可作為載體實現向機體靶標遞送槲皮素并提升其生物利用度，另一方面可賦予該材料新的性能[16-17]。因此，從理論上所得產物槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯可以在改善淀粉理化特性的同時改善或賦予其抗消化、抗氧化等生物活性。通過雙改性或復合改性可賦予變性淀粉多種功能性質。本研究以甘薯淀粉為原料，在制備得到高取代度羧甲基淀粉的基礎上，通過酯化反應實現其與槲皮素的共價結合，重點探討合成條件（底物配比、活化試劑用量、反應體系pH值）對槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯淀粉（食品級；水分質量分數11.2%，灰分質量分數0.41%，蛋白質量分數0.32%，脂質質量分數0.37%）四川友嘉食品有限公司；槲皮素（二水）（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl）、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）（均為分析純） 上海阿達瑪斯試劑有限公司；異丙醇、濃鹽酸、一氯乙酸、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-26型數顯恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；85-2A型數顯恒溫磁力攪拌器 金壇市科析儀器有限公司；pHS-25CW型pH計 上海般特儀器制造有限公司；SHB-III型循環水式多用真空泵、RE-5298型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；LC-20A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（二極管陣列檢測器） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的制備

高取代度羧甲基甘薯淀粉的制備參照具本植等[18]的方法進行。采用滴定法[19]測得羧甲基甘薯淀粉的羧甲基化度為0.659。稱取一定量羧甲基甘薯淀粉、活化試劑EDC·HCl及催化試劑DMAP分別于體積分數50% DMSO溶液中溶解，配制成一定濃度的槲皮素（二水）DMSO溶液。首先將羧甲基甘薯淀粉溶液、EDC·HCl溶液與槲皮素溶液按一定比例混合，接著加入DMAP溶液，維持體系pH值在一定范圍，35 ℃磁力攪拌避光反應16 h。反應結束后加入4 倍體積的無水乙醇靜置30 min醇沉，收集沉淀用甲醇反復淋洗，加入30 mL 50% DMSO溶液將產物再次溶解，經醇沉、淋洗3 次后置于40 ℃真空干燥箱干燥48 h，即得黃色粉末狀槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯。

圖1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成路線圖Fig.1 Synthesis scheme of quercetin-carboxymethyl sweet potato starch ester

以甘薯淀粉作為原料，經一次羧甲基化制備得到羧甲基化度為0.659的羧甲基甘薯淀粉，槲皮素與羧甲基甘薯淀粉通過EDC·HCl和DMAP介導的酯化反應生成槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯（圖1）?；罨噭〦DC·HCl廣泛用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成[20-21]，在酯化過程中與羧甲基甘薯淀粉反應生成中間體O-酰基異脲，隨后在催化劑DMAP的作用下，O-?；愲迮c槲皮素羥基發生親核反應生成槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯[22]。

1.3.2 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的測定

樣品前處理：稱取0.1 g槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，磁力攪拌6 h使槲皮素水解釋放。用6 mol/L鹽酸溶液調節pH 0.5，在分液漏斗中用90 mL乙酸乙酯分3 次萃取，合并有機層，60 ℃旋蒸至干，用甲醇溶解并定容，過0.45 μm濾膜后用HPLC測定釋放的槲皮素含量。

H P L C條件：色譜柱：T h e r m o B D S C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為2%磷酸溶液，B相為色譜級甲醇；檢測條件：A相-B相體積比15∶85，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長293 nm。

標準曲線制作：用DMSO配制質量濃度為1 g/mL槲皮素（二水）儲備液，稀釋至1、2.5、5、7.5、10、15、20 mg/mL，取不同質量濃度溶液1 mL于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，按照上述方法對樣品處理（水解、萃取、旋蒸、定容、過濾膜）后進行HPLC分析。以標準槲皮素（二水）的質量（mg）為橫坐標（x），其峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到回歸方程y=670 800x－562 210，R2=0.995 1。

取代度的計算：按照上述HPLC條件測定樣品經前處理后釋放槲皮素的峰面積，經回歸方程計算得到槲皮素（二水）含量并轉換為物質的量，取代度按照下式計算：

式中：162為脫氧葡萄糖單元的相對分子質量；18為水分子的相對分子質量；338為槲皮素（二水）的相對分子質量；n為槲皮素（二水）的物質的量/mol。

1.3.3 單因素試驗

預實驗結果表明，反應溫度和反應時間對產物槲皮素取代度的影響不顯著，因此選擇對取代度有顯著性影響的參數（底物配比、活化劑與淀粉配比和反應體系pH值）作進一步考察。

固定羧甲基甘薯淀粉質量濃度51 g/L、反應溫度35 ℃、EDC與脫水葡萄糖基（anhydroglucose unit，AGU）物質的量比（NEDC/AGU）1.2∶1、反應體系pH 7.4，考察底物配比（槲皮素（二水）與羧甲基甘薯淀粉中AGU的物質的量比，N槲皮素/AGU）0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1對酯化反應取代度的影響；固定反應溫度35 ℃、N槲皮素/AGU1.0∶1、反應pH 7.4，考察NEDC/AGU為0.6∶1、1.2∶1、1.8∶1、2.4∶1、3.0∶1時對酯化反應取代度的影響；固定反應溫度35 ℃、N槲皮素/AGU1.0∶1、NEDC/AGU1.2∶1，考察反應體系pH值為5.0、5.8、6.6、7.4、8.2、9.0時對酯化反應取代度的影響。

1.3.4 響應面試驗

結合單因素試驗結果，根據Box-Behnken設計原理，設計3因素3水平響應面試驗。考察影響酯化反應槲皮素取代度的3 個因素：N槲皮素/AGU（X1）、NEDC/AGU（X2）及反應體系pH值（X3）對產物槲皮素取代度的影響，因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table1 Codes and levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數據分析與處理

用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0進行數據分析。每個樣品測定3 次，數據以表示。方差分析用Tukey’s HSD進行分析（P＜0.05，顯著差異）。

2 結果與分析

2.1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成

槲皮素在羧甲基甘薯淀粉上的共價結合可通過HPLC測定堿水解釋放出的槲皮素得到證實。此外，反應過程中體系溶解性的變化也反映了酯化反應的進行。原本澄清的均相體系隨反應進行逐漸渾濁并發生分層，表明相對于羧甲基甘薯淀粉，槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的水溶性下降。研究指出，淀粉與松香酸發生酯化反應后的產物[23]以及烷基取代淀粉[24]水溶性較差，原因在于這些產物中出現了大量疏水性基團。如圖2所示，得到的槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯為淡黃色粉末，其顏色隨取代度提高逐漸加深。

圖2 不同取代度槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯與羧甲基甘薯淀粉的顏色變化Fig.2 Color profiles of quercetin-carboxymethyl sweet-potato starch esters with different DS values

2.2 底物配比N槲皮素/AGU對酯化反應的影響

由圖3可知，當N槲皮素/AGU為0.5∶1時，產物的取代度較低。在N槲皮素/AGU≤2.0∶1時，產物的取代度隨槲皮素濃度的增大而顯著提高（P＜0.05），但之后再增加槲皮素濃度對取代度的影響不顯著（P＞0.05）。這可能是由于槲皮素起初濃度的增加使得槲皮素分子與中間體O-酰基異脲碰撞的概率增大，從而提高槲皮素偶聯的概率，但槲皮素濃度增加到一定程度后，中間體被槲皮素分子所飽和，槲皮素濃度不再是偶聯反應的限制性因素，取代度不再增加[25]。在后續響應面試驗設計中，底物配比選擇N槲皮素/AGU1.0∶1～2.0∶1進行考察。

圖3 底物配比（N槲皮素/AGU）對酯化反應的影響Fig.3 Effect of Nquercetin/AGU on DS

2.3 活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）對酯化反應的影響

活化劑EDC·HCl具有碳二亞胺（—N=C=N—）官能團，主要用來活化羧基，促進酰胺化反應或酯化反應[26-27]。由圖4可知，槲皮素取代度隨NEDC/AGU的增加呈先增大后減小的趨勢，NEDC/AGU從0.6∶1增加到1.2∶1，產物取代度提升1.3 倍；NEDC/AGU增加到1.8∶1時取代度的提升不明顯；NEDC/AGU繼續增加則導致產物取代度下降。這說明適當增加EDC·HCl濃度對酯化反應是有益的，過量的EDC·HCl使副反應加劇導致產品取代度下降[25]。在后續響應面設計試驗中，活化劑與淀粉配比選擇NEDC/AGU0.6∶1～1.8∶1進行考察。

圖4 活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）對酯化反應的影響Fig.4 Effect of NEDC/AGU on DS

2.4 反應體系pH值對酯化反應的影響

圖5 反應體系pH值對酯化反應的影響Fig.5 Effect of initial reaction pH on DS

從圖5可以看出，反應體系pH值對槲皮素取代度具有顯著影響（P＜0.05）。在pH 5～9范圍內，隨pH值升高，取代度呈現先升高后下降的趨勢，并在pH 7.4時取代度達到最大值。原因在于，槲皮素的解離常數為pK17.03和pK29.15[28]，偏堿性環境有利于酚羥基的解離，因此槲皮素在弱堿性條件下容易偶聯到中間體O-酰基異脲上，但槲皮素在堿性環境中變得不穩定易降解，且堿性過強會引起淀粉的脫氧葡萄糖單元上的羥基解離，此后pH值的升高反而使取代度下降。鑒于槲皮素在酸性或堿性情況下均容易降解，在后續響應面設計試驗中，pH值范圍選擇5.8～7.4進行考察。

2.5 響應面試驗結果與分析

表2 取代度的Box-Behnken 試驗方案與結果Table2 Box-Behnken design with experimental and predicted DS values

對表2數據進行多元回歸擬合，得到槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的多元二次回歸方程為取代度=0.475+0.778X1+0.048 4X2－0.193X3+0.014 7X1X2－0.008 44X1X3+0.001 04X2X3－0.009 63－0.007 03+0.017 4。

從表3可以看出，模型P值為0.005 3（P＜0.01）極顯著相關，失擬項P值為0.061 4（P＞0.05）不顯著，模型總相關系數R2值為0.915，說明模型選擇合適，擬合度良好。用該模型預測分析不同反應條件下制得的槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的取代度，能較好地描述合成工藝中產物取代度隨參數條件的變化規律。從表3還可以看出，二次項和交互項對槲皮素-羧甲基甘薯淀粉的取代度影響不顯著（P＞0.05），單因素X2和X3對取代度的影響極顯著（P＜0.01）。在所選因素范圍內，各因素對槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影響排序為活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）＞反應體系pH值＞底物配比（N槲皮素/AGU）。

表3 取代度的二次響應模型方差分析Table3 Analysis of variance (ANOVA) for the response surface quadratic model describing the effect of variables on DS

2.6 響應面分析及模型驗證實驗結果

圖6 底物配比、活化劑與淀粉配比和反應體系pH值對槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plots showing the interactive effects of variables on DS

從圖6A和6C可知，分別固定N槲皮素/AGU和反應體系pH值時，產物取代度都隨NEDC/AGU的增大而增大，呈現線性關系，且從圖6A能看出，當N槲皮素/AGU相對較高時，EDC對取代度的影響更為顯著；從圖6A和6B可知，N槲皮素/AGU的變化對產物取代度的影響并不顯著，這在方差分析（表3）中也有體現，只有當pH值較低或EDC濃度較高時，N槲皮素/AGU才對反應產物的槲皮素取代度有一定影響，且這種影響是正相關的；從圖6B和6C得到，分別固定N槲皮素/AGU和NEDC/AGU時，pH值對槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影響較為顯著，pH值上升，產物取代度增加，這與單因素試驗的趨勢相同。

按照Design-Expert 8.0軟件給定的最優工藝參數底物配比（N槲皮素/AGU，X1）2∶1、活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU，X2）1.8∶1、反應體系pH（X3）7.4時，進行3 次驗證實驗，實測產物的取代度為0.114 9±0.007 5，與預測值（0.122 5）相比較差異不顯著（P＞0.05），證明該回歸方程的可靠性（相對誤差6.14%）。

3 結 論

以甘薯淀粉為原料，依次經過羧甲基化、槲皮素共價結合兩步改性，得到新型變性淀粉槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯。研究發現，產物的槲皮素取代度受底物配比（N槲皮素/AGU）、活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）和反應體系pH值的控制。獲得制備槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的最佳參數條件為N槲皮素/AGU2∶1，NEDC/AGU1.8∶1、反應體系pH 7.4，制備得到的產物槲皮素的取代度為0.114 9。