槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成

葉發(fā)銀，呂 霞，李金鳳，王勇德，趙國(guó)華,3,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065；3.重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

作為食品配料，淀粉在食品中用途廣泛。隨著食品工業(yè)對(duì)食品配料性能要求的不斷提高，原淀粉的有些性質(zhì)已不能滿足要求。通常采用物理法、化學(xué)法或酶法改造原淀粉得到變性淀粉，以滿足食品加工所需功能性質(zhì)[1]。其中，化學(xué)改性是增加或提高淀粉功能性質(zhì)的有效方法，全球約80%的變性淀粉采用化學(xué)法生產(chǎn)[2]。相比原淀粉，變性淀粉具有更優(yōu)良的性質(zhì)，如黏度低且穩(wěn)定、凝沉性弱、成膜性好、溶解性或透明度更高[3]。有些變性淀粉可用作營(yíng)養(yǎng)物或食品功能因子靶向輸送載體，在功能食品領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[4-5]。通過(guò)化學(xué)改性調(diào)控淀粉消化特性的研究也非常活躍。Han等[6]發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)玉米淀粉經(jīng)交聯(lián)-羥丙基化處理可獲得慢消化淀粉含量高（21%）的產(chǎn)品，經(jīng)交聯(lián)-乙酰化處理可獲得抗消化淀粉含量高（24%）的產(chǎn)品，經(jīng)辛烯基琥珀酸酐處理則可以同時(shí)提高產(chǎn)品中慢消化淀粉和抗消化淀粉含量。He Jinhua等[7]認(rèn)為辛烯基琥珀酸酐改性最適合用來(lái)制備慢消化淀粉（28.3%），原因在于辛烯基琥珀酸基團(tuán)對(duì)淀粉酶有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，影響淀粉酶對(duì)淀粉催化水解。Carlos-Amaya等[8]研究了化學(xué)改性香蕉淀粉對(duì)其消化性的影響，結(jié)果表明，單獨(dú)酯化或交聯(lián)處理可顯著增加慢消化淀粉含量，采用酯化-交聯(lián)處理則可以顯著增加抗消化淀粉含量。Shah等[9]研究發(fā)現(xiàn)燕麥淀粉經(jīng)乙酰化改性后，其抗消化淀粉的含量可提高2 倍。

近年來(lái)，具有生物活性的變性淀粉開(kāi)發(fā)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的興趣。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉硫酸酯[10]和雙醛淀粉[11]具有較好的自由基清除能力。Mathew[12]和Wen Yu[13]等分別將阿魏酸共價(jià)結(jié)合到馬鈴薯淀粉及玉米淀粉上，均得到具有抗氧化活性的產(chǎn)物。Tan Wenqiang等[14]通過(guò)多步反應(yīng)得到具有良好抑菌活性的三氮唑淀粉衍生物。

槲皮素是果蔬食品原料中常見(jiàn)的黃酮類物質(zhì)，具有多種有益的生理及藥理活性[15]。研究發(fā)現(xiàn)，將槲皮素共價(jià)結(jié)合到一些高分子材料上，一方面可作為載體實(shí)現(xiàn)向機(jī)體靶標(biāo)遞送槲皮素并提升其生物利用度，另一方面可賦予該材料新的性能[16-17]。因此，從理論上所得產(chǎn)物槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯可以在改善淀粉理化特性的同時(shí)改善或賦予其抗消化、抗氧化等生物活性。通過(guò)雙改性或復(fù)合改性可賦予變性淀粉多種功能性質(zhì)。本研究以甘薯淀粉為原料，在制備得到高取代度羧甲基淀粉的基礎(chǔ)上，通過(guò)酯化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)其與槲皮素的共價(jià)結(jié)合，重點(diǎn)探討合成條件（底物配比、活化試劑用量、反應(yīng)體系pH值）對(duì)槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯淀粉（食品級(jí)；水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.2%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.41%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.32%，脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.37%）四川友嘉食品有限公司；槲皮素（二水）（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl）、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）（均為分析純） 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；異丙醇、濃鹽酸、一氯乙酸、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-26型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；85-2A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 金壇市科析儀器有限公司；pHS-25CW型pH計(jì) 上海般特儀器制造有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵、RE-5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LC-20A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（二極管陣列檢測(cè)器） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的制備

高取代度羧甲基甘薯淀粉的制備參照具本植等[18]的方法進(jìn)行。采用滴定法[19]測(cè)得羧甲基甘薯淀粉的羧甲基化度為0.659。稱取一定量羧甲基甘薯淀粉、活化試劑EDC·HCl及催化試劑DMAP分別于體積分?jǐn)?shù)50% DMSO溶液中溶解，配制成一定濃度的槲皮素（二水）DMSO溶液。首先將羧甲基甘薯淀粉溶液、EDC·HCl溶液與槲皮素溶液按一定比例混合，接著加入DMAP溶液，維持體系pH值在一定范圍，35 ℃磁力攪拌避光反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后加入4 倍體積的無(wú)水乙醇靜置30 min醇沉，收集沉淀用甲醇反復(fù)淋洗，加入30 mL 50% DMSO溶液將產(chǎn)物再次溶解，經(jīng)醇沉、淋洗3 次后置于40 ℃真空干燥箱干燥48 h，即得黃色粉末狀槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯。

圖1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成路線圖Fig.1 Synthesis scheme of quercetin-carboxymethyl sweet potato starch ester

以甘薯淀粉作為原料，經(jīng)一次羧甲基化制備得到羧甲基化度為0.659的羧甲基甘薯淀粉，槲皮素與羧甲基甘薯淀粉通過(guò)EDC·HCl和DMAP介導(dǎo)的酯化反應(yīng)生成槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯（圖1）。活化試劑EDC·HCl廣泛用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成[20-21]，在酯化過(guò)程中與羧甲基甘薯淀粉反應(yīng)生成中間體O-酰基異脲，隨后在催化劑DMAP的作用下，O-酰基異脲與槲皮素羥基發(fā)生親核反應(yīng)生成槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯[22]。

1.3.2 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的測(cè)定

樣品前處理：稱取0.1 g槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，磁力攪拌6 h使槲皮素水解釋放。用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 0.5，在分液漏斗中用90 mL乙酸乙酯分3 次萃取，合并有機(jī)層，60 ℃旋蒸至干，用甲醇溶解并定容，過(guò)0.45 μm濾膜后用HPLC測(cè)定釋放的槲皮素含量。

H P L C條件：色譜柱：T h e r m o B D S C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為2%磷酸溶液，B相為色譜級(jí)甲醇；檢測(cè)條件：A相-B相體積比15∶85，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)293 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用DMSO配制質(zhì)量濃度為1 g/mL槲皮素（二水）儲(chǔ)備液，稀釋至1、2.5、5、7.5、10、15、20 mg/mL，取不同質(zhì)量濃度溶液1 mL于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，按照上述方法對(duì)樣品處理（水解、萃取、旋蒸、定容、過(guò)濾膜）后進(jìn)行HPLC分析。以標(biāo)準(zhǔn)槲皮素（二水）的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)（x），其峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=670 800x－562 210，R2=0.995 1。

取代度的計(jì)算：按照上述HPLC條件測(cè)定樣品經(jīng)前處理后釋放槲皮素的峰面積，經(jīng)回歸方程計(jì)算得到槲皮素（二水）含量并轉(zhuǎn)換為物質(zhì)的量，取代度按照下式計(jì)算：

式中：162為脫氧葡萄糖單元的相對(duì)分子質(zhì)量；18為水分子的相對(duì)分子質(zhì)量；338為槲皮素（二水）的相對(duì)分子質(zhì)量；n為槲皮素（二水）的物質(zhì)的量/mol。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物槲皮素取代度的影響不顯著，因此選擇對(duì)取代度有顯著性影響的參數(shù)（底物配比、活化劑與淀粉配比和反應(yīng)體系pH值）作進(jìn)一步考察。

固定羧甲基甘薯淀粉質(zhì)量濃度51 g/L、反應(yīng)溫度35 ℃、EDC與脫水葡萄糖基（anhydroglucose unit，AGU）物質(zhì)的量比（NEDC/AGU）1.2∶1、反應(yīng)體系pH 7.4，考察底物配比（槲皮素（二水）與羧甲基甘薯淀粉中AGU的物質(zhì)的量比，N槲皮素/AGU）0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1對(duì)酯化反應(yīng)取代度的影響；固定反應(yīng)溫度35 ℃、N槲皮素/AGU1.0∶1、反應(yīng)pH 7.4，考察NEDC/AGU為0.6∶1、1.2∶1、1.8∶1、2.4∶1、3.0∶1時(shí)對(duì)酯化反應(yīng)取代度的影響；固定反應(yīng)溫度35 ℃、N槲皮素/AGU1.0∶1、NEDC/AGU1.2∶1，考察反應(yīng)體系pH值為5.0、5.8、6.6、7.4、8.2、9.0時(shí)對(duì)酯化反應(yīng)取代度的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。考察影響酯化反應(yīng)槲皮素取代度的3 個(gè)因素：N槲皮素/AGU（X1）、NEDC/AGU（X2）及反應(yīng)體系pH值（X3）對(duì)產(chǎn)物槲皮素取代度的影響，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Codes and levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣品測(cè)定3 次，數(shù)據(jù)以表示。方差分析用Tukey’s HSD進(jìn)行分析（P＜0.05，顯著差異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成

槲皮素在羧甲基甘薯淀粉上的共價(jià)結(jié)合可通過(guò)HPLC測(cè)定堿水解釋放出的槲皮素得到證實(shí)。此外，反應(yīng)過(guò)程中體系溶解性的變化也反映了酯化反應(yīng)的進(jìn)行。原本澄清的均相體系隨反應(yīng)進(jìn)行逐漸渾濁并發(fā)生分層，表明相對(duì)于羧甲基甘薯淀粉，槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的水溶性下降。研究指出，淀粉與松香酸發(fā)生酯化反應(yīng)后的產(chǎn)物[23]以及烷基取代淀粉[24]水溶性較差，原因在于這些產(chǎn)物中出現(xiàn)了大量疏水性基團(tuán)。如圖2所示，得到的槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯為淡黃色粉末，其顏色隨取代度提高逐漸加深。

圖2 不同取代度槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯與羧甲基甘薯淀粉的顏色變化Fig.2 Color profiles of quercetin-carboxymethyl sweet-potato starch esters with different DS values

2.2 底物配比N槲皮素/AGU對(duì)酯化反應(yīng)的影響

由圖3可知，當(dāng)N槲皮素/AGU為0.5∶1時(shí)，產(chǎn)物的取代度較低。在N槲皮素/AGU≤2.0∶1時(shí)，產(chǎn)物的取代度隨槲皮素濃度的增大而顯著提高（P＜0.05），但之后再增加槲皮素濃度對(duì)取代度的影響不顯著（P＞0.05）。這可能是由于槲皮素起初濃度的增加使得槲皮素分子與中間體O-酰基異脲碰撞的概率增大，從而提高槲皮素偶聯(lián)的概率，但槲皮素濃度增加到一定程度后，中間體被槲皮素分子所飽和，槲皮素濃度不再是偶聯(lián)反應(yīng)的限制性因素，取代度不再增加[25]。在后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，底物配比選擇N槲皮素/AGU1.0∶1～2.0∶1進(jìn)行考察。

圖3 底物配比（N槲皮素/AGU）對(duì)酯化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of Nquercetin/AGU on DS

2.3 活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）對(duì)酯化反應(yīng)的影響

活化劑EDC·HCl具有碳二亞胺（—N=C=N—）官能團(tuán)，主要用來(lái)活化羧基，促進(jìn)酰胺化反應(yīng)或酯化反應(yīng)[26-27]。由圖4可知，槲皮素取代度隨NEDC/AGU的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，NEDC/AGU從0.6∶1增加到1.2∶1，產(chǎn)物取代度提升1.3 倍；NEDC/AGU增加到1.8∶1時(shí)取代度的提升不明顯；NEDC/AGU繼續(xù)增加則導(dǎo)致產(chǎn)物取代度下降。這說(shuō)明適當(dāng)增加EDC·HCl濃度對(duì)酯化反應(yīng)是有益的，過(guò)量的EDC·HCl使副反應(yīng)加劇導(dǎo)致產(chǎn)品取代度下降[25]。在后續(xù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，活化劑與淀粉配比選擇NEDC/AGU0.6∶1～1.8∶1進(jìn)行考察。

圖4 活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）對(duì)酯化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of NEDC/AGU on DS

2.4 反應(yīng)體系pH值對(duì)酯化反應(yīng)的影響

圖5 反應(yīng)體系pH值對(duì)酯化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of initial reaction pH on DS

從圖5可以看出，反應(yīng)體系pH值對(duì)槲皮素取代度具有顯著影響（P＜0.05）。在pH 5～9范圍內(nèi)，隨pH值升高，取代度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并在pH 7.4時(shí)取代度達(dá)到最大值。原因在于，槲皮素的解離常數(shù)為pK17.03和pK29.15[28]，偏堿性環(huán)境有利于酚羥基的解離，因此槲皮素在弱堿性條件下容易偶聯(lián)到中間體O-酰基異脲上，但槲皮素在堿性環(huán)境中變得不穩(wěn)定易降解，且堿性過(guò)強(qiáng)會(huì)引起淀粉的脫氧葡萄糖單元上的羥基解離，此后pH值的升高反而使取代度下降。鑒于槲皮素在酸性或堿性情況下均容易降解，在后續(xù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，pH值范圍選擇5.8～7.4進(jìn)行考察。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 取代度的Box-Behnken 試驗(yàn)方案與結(jié)果Table2 Box-Behnken design with experimental and predicted DS values

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的多元二次回歸方程為取代度=0.475+0.778X1+0.048 4X2－0.193X3+0.014 7X1X2－0.008 44X1X3+0.001 04X2X3－0.009 63－0.007 03+0.017 4。

從表3可以看出，模型P值為0.005 3（P＜0.01）極顯著相關(guān)，失擬項(xiàng)P值為0.061 4（P＞0.05）不顯著，模型總相關(guān)系數(shù)R2值為0.915，說(shuō)明模型選擇合適，擬合度良好。用該模型預(yù)測(cè)分析不同反應(yīng)條件下制得的槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的取代度，能較好地描述合成工藝中產(chǎn)物取代度隨參數(shù)條件的變化規(guī)律。從表3還可以看出，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)槲皮素-羧甲基甘薯淀粉的取代度影響不顯著（P＞0.05），單因素X2和X3對(duì)取代度的影響極顯著（P＜0.01）。在所選因素范圍內(nèi)，各因素對(duì)槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影響排序?yàn)榛罨瘎┡c淀粉配比（NEDC/AGU）＞反應(yīng)體系pH值＞底物配比（N槲皮素/AGU）。

表3 取代度的二次響應(yīng)模型方差分析Table3 Analysis of variance (ANOVA) for the response surface quadratic model describing the effect of variables on DS

2.6 響應(yīng)面分析及模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 底物配比、活化劑與淀粉配比和反應(yīng)體系pH值對(duì)槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plots showing the interactive effects of variables on DS

從圖6A和6C可知，分別固定N槲皮素/AGU和反應(yīng)體系pH值時(shí)，產(chǎn)物取代度都隨NEDC/AGU的增大而增大，呈現(xiàn)線性關(guān)系，且從圖6A能看出，當(dāng)N槲皮素/AGU相對(duì)較高時(shí)，EDC對(duì)取代度的影響更為顯著；從圖6A和6B可知，N槲皮素/AGU的變化對(duì)產(chǎn)物取代度的影響并不顯著，這在方差分析（表3）中也有體現(xiàn)，只有當(dāng)pH值較低或EDC濃度較高時(shí)，N槲皮素/AGU才對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的槲皮素取代度有一定影響，且這種影響是正相關(guān)的；從圖6B和6C得到，分別固定N槲皮素/AGU和NEDC/AGU時(shí)，pH值對(duì)槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影響較為顯著，pH值上升，產(chǎn)物取代度增加，這與單因素試驗(yàn)的趨勢(shì)相同。

按照Design-Expert 8.0軟件給定的最優(yōu)工藝參數(shù)底物配比（N槲皮素/AGU，X1）2∶1、活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU，X2）1.8∶1、反應(yīng)體系pH（X3）7.4時(shí)，進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測(cè)產(chǎn)物的取代度為0.114 9±0.007 5，與預(yù)測(cè)值（0.122 5）相比較差異不顯著（P＞0.05），證明該回歸方程的可靠性（相對(duì)誤差6.14%）。

3 結(jié) 論

以甘薯淀粉為原料，依次經(jīng)過(guò)羧甲基化、槲皮素共價(jià)結(jié)合兩步改性，得到新型變性淀粉槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的槲皮素取代度受底物配比（N槲皮素/AGU）、活化劑與淀粉配比（NEDC/AGU）和反應(yīng)體系pH值的控制。獲得制備槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的最佳參數(shù)條件為N槲皮素/AGU2∶1，NEDC/AGU1.8∶1、反應(yīng)體系pH 7.4，制備得到的產(chǎn)物槲皮素的取代度為0.114 9。