基于頂空氣相色譜-離子遷移譜技術的冷凍豬肉貯藏時間快速判別方法

王 輝，田寒友，李文采，鄒 昊，劉 飛，白 京，李家鵬，陳文華，喬曉玲

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京食品科學研究院，北京 100068）

冷凍貯藏是一種在一定貯藏時間內維持豬肉良好品質狀態的常規貯藏方法，可以最大程度地抑制和減緩與豬肉腐敗變質相關的生理生化反應。在長時間冷凍貯藏過程中，蛋白質氧化、脂肪氧化、微生物及冰晶的傳熱傳質等因素導致的劣變效果疊加會大大降低冷凍豬肉的感官品質、食用品質及加工性能。加之近年來發生了多起“僵尸肉”和“過期肉”事件，導致企業和民眾對于冷凍豬肉貯藏時間的質疑及其食用安全性的擔憂，如何判別冷凍豬肉的貯藏時間已成為亟待解決的課題。

貯藏時間的延長不僅會導致冷凍豬肉品質劣變及食用安全性下降，還會對交易價格造成較大的影響，因此國家標準和相關部委文件[1-5]對加工原料肉和應急儲備肉都有明確的冷凍貯藏時間要求。通常情況下，個人食用的冷凍豬肉一般貯藏1 個月，而儲備冷凍豬肉的強制輪換期為6 個月[6]，加工冷凍豬肉的保質期為12 個月。在大宗冷凍豬肉原料交易過程中，貯藏時間的長短主要是對肉色褐變、干耗、蛋白質腐敗和脂肪酸敗產生的氣味等品質劣變的程度進行感官評定，或采用針對性較強的理化指標檢測進行判斷。對于劣變現象和指標的評估是基于改變整塊冷凍豬肉凍結狀態的基礎上進行的，評判結果由于受到解凍和檢測過程中多重因素的影響，極易受到認知水平和主觀差異性的影響而造成誤判，因此常規的感官評定和檢測方法無法滿足大宗交易和批量檢驗對評估效果及效率的要求。通過對貯藏過程中導致冷凍豬肉品質劣變的主因、劣變發生位置、劣變產生的特征性表征物質及檢測方法繁簡程度的分析，選擇冷凍豬肉表層或淺表層脂肪氧化所產生的揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs）作為氣味劣變的氣體分析項。與常規檢測方法相比，氣體分析具有無需改變樣品狀態、樣品耗損少、操作簡單、分析快捷及數據解釋能力強等特點。通過VOCs種類和濃度的變化，可獲得不同貯藏時間冷凍豬肉的脂肪氧化程度和VOCs組成特征等信息，并結合化學計量法進行聚類分析以判別該分析結果是否符合對應貯藏時間的數據特征。現階段主流的氣體分析方法是氣相色譜-質譜法，而該方法對于極性相近的物質及同分異構體分辨率較差，且對痕量物質的靈敏度較低。在低溫條件下緩慢進行的脂肪氧化所產生的VOCs會因此不足而導致分析數據的缺失或漏檢，由此導致對貯藏時間的誤判。

近年，一種基于氣相色譜（gas chromatography，GC）和離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）的聯用技術逐漸應用于食品研究，該項技術通過整合二者在分離和檢測方面的優勢，形成具有高分辨率、高靈敏度、分析高效、操作簡便等特點的氣體快檢技術。此前GC-IMS技術主要應用于對爆炸物[7]、毒品[8]、化學戰劑[9]、石化產品[10]、環境質量[11]及人體健康[12]等方面的檢測、分析和預警，近些年才逐漸開展在食品上的應用研究，國內外相關文獻較少且主要集中于酒[13]、茶葉[14]、植物油[15-17]及摻假[18-19]等方面，且鮮見在鮮凍肉品上應用的報道。

本研究以冷凍豬IV號肉為實驗原料，以冷凍豬肉的個人消費周期、儲備輪換周期及加工保質期為檢測時間節點，采用頂空GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GCIMS）對冷凍豬肉在不同貯藏時間內產生的VOCs進行采集和分析，利用化學計量法處理數據后進行聚類分析，使用已知貯藏時間的樣品進行性能驗證，并以數據可視化形式顯示該方法的判別效果，為該項快檢技術的實際應用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為新鮮宰殺并速凍后的冷凍豬IV號肉（由塑料包裝膜緊密包裹），購自北京中瑞食品有限公司，存儲于同一間－18℃冷庫。所有分離用有機溶劑、滴定標準液及指示劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec?食品風味分析與質量控制系統（配有CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search定性軟件的GC-IMS系統） 德國G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

檢測時間設置為0、1、6、12 個月，HS-GC-IMS的取樣方法為實驗時從與包裝膜緊密貼合的冷凍豬肉表層不同位置處刮取肉樣共計5 g，裝入進樣瓶中備檢。每次取3 份樣品用于3 項指標和HS-GC-IMS分析。

1.3.2 揮發性鹽基氮的檢測

根據GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[20]進行檢測。

1.3.3 酸價的檢測

根據GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》[21]進行檢測。

1.3.4 過氧化值的檢測

根據GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[22]進行檢測。

1.3.5 HS-GC-IMS分析

1.3.5.1 自動進樣器條件

孵化溫度55 ℃；孵化時間5 min；進樣方式為頂空進樣；加熱方式為振蕩加熱；振蕩速率500 r/min；進樣針溫度85 ℃；進樣量500 μL，不分流；清洗時間0.5 min。

1.3.5.2 GC條件

FS-SE-54-CB-0.5石英毛細管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；色譜柱溫度40 ℃；載氣為N2（純度≥99.999%）；載氣流速程序：初始流速2.0 mL/min，3 min內線性升至17.0 mL/min，5 min內線性升至100.0 mL/min，保持7 min；運行時間15 min。

1.3.5.3 IMS條件

漂移管長度98 mm；管內線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為N2（純度≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源：β射線（氚，3H）；離子化模式：正離子。

1.4 數據處理

采用設備自帶Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search定性軟件對冷凍豬肉中的VOCs進行采集和分析，并采用Matlab R2014a進行主成分分析（principal component analysis，PCA）及K均值聚類分析。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中冷凍豬肉的品質變化

圖1 貯藏過程中冷凍豬肉揮發性鹽基氮、酸價及過氧化值變化情況Fig.1 Changes in TVB-N content, AV and POV of pork during frozen storage

通常情況下，對于冷凍豬肉的品質變化主要采用國家標準中的揮發性鹽基氮法來檢驗，并以酸價及過氧化值輔助評估[23]，由此判斷冷凍豬肉的蛋白質腐敗[20]和脂肪酸敗[24]程度。如圖1所示，揮發性鹽基氮、酸價、過氧化值的相關系數R2分別為0.981 6、0.842 2、0.785 5，均與貯藏時間有相對較好的相關性。揮發性鹽基氮、酸價和過氧化值均可在一定程度上作為表征品質劣變[23,25]的指標來判斷冷凍豬肉的貯藏時間，但在實際操作過程中，環境因素和人為因素對冷凍豬肉的解凍、粉碎、檢測目標物提取及滴定分析等環節的影響會導致檢測值發生不同程度的偏差，因此樣品狀態變化、操作步驟繁瑣、前處理和檢測時間長、對人員技術要求高等缺陷限制了以上3 個指標在批量冷凍豬肉交易和檢測中的應用。

2.2 不同貯藏時間冷凍豬肉的HS-GC-IMS分析

隨著速凍技術、低溫恒濕貯藏技術和復合包裝技術在冷凍貯藏中的應用，溫度和濕度波動導致冰晶以水蒸氣的形式在冷凍豬肉表面與環境之間發生的傳熱傳質過程，受到具有阻水阻氣特性的外包裝膜和外包裝箱構成的內環境的緩沖保護，冰晶升華現象減弱，使干耗現象導致的多孔脫水活化層向肉品內部移動的趨勢受到抑制，因此作為品質劣變主因的脂肪氧化主要作用于冷凍豬肉的表層或淺表層[26-27]。HS-GC-IMS分析時，以凍結狀態提取樣品表層或淺表層組織進行頂空進樣，最大程度地保護脂肪氧化產生的VOCs組分特征，避免樣品中易揮發物質由于外界溫度波動而導致的損失，確保分析數據的準確性和穩定性。

圖2 不同貯藏時間冷凍豬肉的HS-GC-IMS譜圖（a）和三維譜圖（b）比較Fig.2 Comparison of 3D HS-GC-IMS spectra of frozen pork at different storage times

圖2a中縱坐標為GC分離時VOCs的保留時間，橫坐標為IMS分離時VOCs相對于反應離子峰的漂移時間。圖2b中第三維坐標為VOCs在IMS中的離子峰強度。HS-GCIMS根據樣品中復雜VOCs組分與色譜柱固定相之間作用力強弱進行初步GC分離，不同保留時間流出的組分以氣態分子的形式被離子源軟電離后形成分子離子群，由于組分離子在質量、碰撞截面和電荷數等因素上的差異，在環境氣壓下由周期性離子脈沖驅動先后進入線性漂移電場并獲得不同的遷移速率并進行二次分離，通過獲取離子漂移時間和離子峰強度可分別對各組分進行定性和定量分析。從圖2可看出，由于沒有豬肉熱加工時所呈現的復雜風味物質體系，冷凍豬肉中VOCs在600 s內完成GC分離，30 ms內完成IMS分離且分離度較高，圖2a中A框和B框內GC分離時保留時間較近的物質在IMS中較好地分離。

由圖2可以看出，不同貯藏時間冷凍豬肉VOCs的差異主要表現在離子峰的位置、數量、強度及時間上。從圖2a中C、D、E、F、G方框中明顯地看出具有相同保留時間和漂移時間的VOCs，其斑點的有無和顏色的深淺，表示物質的積累和分解程度，由此可看出不同貯藏時間的冷凍豬肉由于氧化程度的不同，VOCs的種類和濃度也隨之變化。在冷凍貯藏過程中，脂肪的自動氧化和光氧化并不因為低溫而停止，而是緩慢并持續地進行鏈式反應直到自由基相互碰撞產生惰性聚合體，在此過程中產生的氫過氧化物不斷裂解成醛、酮、酸、酯及醇類等小分子揮發性有機物，隨著濃度的不斷增大最終導致酸敗味的產生，因此可通過VOCs的種類增減和相對應物質的濃度變化來判斷冷凍豬肉的貯藏時間。

2.3 冷凍豬肉中VOCs的變化分析

圖3 不同貯藏時間冷凍豬肉HS-GC-IMS譜圖中VOCs的圖庫Fig.3 Gallery pattern of VOCs in HS-GC-IMS spectra of frozen pork at different storage times

圖3 為FlavourSpec?系統自帶LAV軟件內置的Gallery Plot插件篩選出的具有明顯變化規律的29 種VOCs的離子峰圖庫。從圖3中VOCs的離子峰排列可明顯看出，相同貯藏時間的冷凍豬肉含有共有VOCs，僅區別于濃度，樣品組內具有明顯的相似性，不同貯藏時間的冷凍豬肉含有對應時間內所特有的VOCs，樣品組間則呈現出明顯的差異性。根據各樣品的VOCs種類和濃度進行相似度分析，見表1，組內相似度均高于90%，組間相似度則較低，說明冷凍貯藏時間越長，脂肪氧化程度越嚴重，組間相似度差異越大，對照組與凍貯12 個月的豬肉相似度只有60%。隨著貯藏時間的延長，冷凍豬肉在A框中的VOCs含量主要呈現遞減趨勢，而B框中的則主要呈現遞增趨勢，其中B框中的14、15號及16號物質從凍貯6 個月時才開始出現，體現在圖2a中C、D方框中斑點的出現，這可能是由于脂肪氧化程度不斷加劇，冷凍豬肉原有VOCs通過氧化過程中不斷與氫過氧化物、氫過氧化物的次級產物、脂肪氧化系統中的活性氧自由基、非血紅素鐵氧化系統中的高活性羥自由基或肌紅蛋白氧化系統中的超鐵肌紅蛋白自由基發生反應而生成其他種類的VOCs[28-31]，由此也造成圖3 A框中VOCs含量降低和B框中VOCs含量增加。

表1 不同貯藏時間冷凍豬肉的相似度分析Table1 Similarity analysis of frozen pork at different storage times

2.4 PCA結果

根據圖3中不同種類VOCs的種類排序及離子峰強度可大致判斷冷凍豬肉所處的貯藏時間，但GC-IMS的二維和三維數據圖形化表達（圖2）對于貯藏時間的判斷仍受到觀測者主觀認知的影響。通過對以VOCs種類為變量的高維數組進行維度壓縮，去除冗余信息和空間噪聲，用少量線性無關的綜合變量替代原有變量，并投影至較低維度的平面上，可便于對不同貯藏時間的冷凍豬肉進行特征差異的可視化分析。由圖4可知，主成分1和主成分2的貢獻率之和大于85%，數據降維后所得綜合變量在二維空間即可表達原有變量的絕大部分信息。通過二維空間的數據分布差異可以直觀地觀察到組間和組內樣品間的差異性，組內各樣品相對集中于一定范圍內，并與其他各組數據的成簇區域有明顯的間距，這說明貯藏時間相同的樣品重復性較好，不同貯藏時間的樣品特異性較明顯。

圖4 不同貯藏時間冷凍豬肉的PCAFig.4 PCA of frozen pork at different storage times

2.5 K均值聚類分析

圖5 不同貯藏時間冷凍豬肉的K均值聚類分析Fig.5 K-means clustering analysis of frozen pork at different storage times

將經PCA處理后的數據應用于聚類分析，并用已知貯藏時間的冷凍豬肉作為檢驗樣品，檢驗其歸類效果。由于在各貯藏時間段采樣數量較少，因此采用K均值聚類算法進行分析，該方法簡單高效，時間復雜度近于線性，收斂速度較快。參與聚類分析的冷凍豬肉樣品的貯藏時間分別為0、1、6 個月及12 個月，因此設置簇數量K為4，采用樣品與質心的平方歐氏距離最小作為樣品歸類的度量標準，并使用K均值++算法為每個簇設置初始質心，如圖5所示。本聚類算法的運算原理為，檢驗樣品集與第1個時間簇進行距離度量后剔除歸類樣品，剩余的樣品再與第2個時間簇進行距離度量，剔除歸類樣品，以此類推，如果所剩樣品與各簇質心的平方歐式距離均不滿足默認最小距離時，則將該樣品作為異常樣品單獨歸為一簇，避免誤判。使用4 份未參加聚類建模的冷凍豬肉作為檢驗樣品，貯藏時間分別0、1、6 個月及12 個月。圖5中無填充色表示的檢驗樣品（T1～T4），相同形狀表示檢驗樣品與建模樣品屬于相同時間簇，可見根據已知貯藏時間樣品所構建的聚類判別模型可有效對相同貯藏時間的樣品進行歸類。因此，使用此方法可對冷凍豬肉的貯藏時間是否符合國家標準及相關部門文件規定進行判別。

3 結 論

本研究分析在大宗交易和批量檢測過程中不宜采用常規理化指標判別貯藏時間的原因，并根據對冷凍豬肉在貯藏過程中發生品質劣變的主因、冷凍豬肉受影響的位置、表征劣變的物質及檢測方法便捷程度的分析，提出一種基于HS-GC-IMS技術的快速判別方法。該方法通過獲取不同貯藏時間內冷凍豬肉表層脂肪氧化產生的VOCs組成特征，并利用PCA降維處理后的數據進行K均值聚類分析，以判別樣品是否符合已知貯藏時間冷凍豬肉所特有的數據特征，結果表明不同貯藏時間的樣品歸類效果良好。

冷凍豬肉在企業冷庫中貯藏時，由于人為因素和不可預見因素，如移庫、出貨、停電等，冷庫中的溫度和濕度波動較大且持續時間較長，冷凍豬肉的VOCs特征會偏離正常貯藏時所具備特征。因此，后期的主要工作是，分析正常冷凍貯藏條件下與溫濕度波動條件下，不同貯藏時間冷凍豬肉的脂肪氧化所導致的VOCs種類差異和變化規律，并建立二者的關系校正模型以避免對貯藏時間判別分析時造成誤判。

此外，通過設置多個檢測時間節點，獲取線性貯藏時間內冷凍豬肉VOCs的組分信息并增加采樣數量，不僅可以增強判別模型的容變性和穩健性，還可由此建立判別冷凍豬肉品質等級的數據庫，為大宗冷凍豬肉交易的價格制定及貯藏時間的真偽判定提供理論依據和數據支持。