基于復雜網絡的中藥半枝蓮系統生物學信息挖掘方法＊

胡晨駿，何 菊，謝佳東，房裴裴，丁有偉，胡孔法，冒宇清

（南京中醫藥大學信息技術學院 南京 210023）

半枝蓮（Scutellaria babarta D.Don），別名，狹葉韓信草，牙刷草等，其名最早見于《外科正宗》，為唇形科植物半枝蓮的全草，其味辛、苦，性寒，歸肺、肝腎經，有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫的功能，是一種常用中藥[1]。利用高效液相色譜法分析不同產地半枝蓮天然化合物成分，共鑒別出100多種天然化合物，主要是黃酮類、二萜類天然化合物成分（表1），其中野黃芩苷含量最高[2，3]。

中醫臨床上半枝蓮是中醫組方重要成分，用于各類癌癥治療，如肝癌、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌[4]。現代藥理學發現半枝蓮天然化合物有抗腫瘤、增強免疫、抗病原微生物、平喘祛痰、利尿、解熱等藥理活性[5]。研究發現半枝蓮天然化合物成分能調節某些基因表達，如 AHSA1、BCL2L1、CASP3[6]、PRKCG[7]和 TYR[8]。但是目前對半枝蓮研究仍然停留在比較基礎的層面，臨床上仍然以半枝蓮復方制劑為主，為了更好發揮半枝蓮藥用價值，有必要對其進行更深入的研究，闡明半枝蓮抗腫瘤活性部位，并且從分子水平研究半枝蓮藥理活性[9]。

本文采用Herb-Prince復雜網絡算法，基于半枝蓮天然化合物和系統生物學數據，通過算法推導與半枝蓮潛在相關的人類基因、基因族以及KEGG信號通路，從系統生物學特別是基因組學角度挖掘其作用機制，為中醫藥研究人員從分子水平研究半枝蓮藥理活性提供決策支持。首先，從HIT數據庫[10]中抽取中藥、天然化合物、靶點基因的信息，準備半枝蓮和靶點基因先驗數據；然后，基于StringDB數據庫[11]中的人類（Homo Sapiens）蛋白質交互網絡（PPIs）信息，通過 Herb-Prince算法計算半枝蓮與各個蛋白質節點關聯系數；最后，選取Top 100基因進行富集分析，挖掘半枝蓮與潛在關聯的基因族以及Top 10 KEGG信號通路。檢索半枝蓮臨床與藥理學研究文獻，驗證挖掘得到的基因族和KEGG信號通路信息的有效性，如果半枝蓮是組方成分或半枝蓮提取物能作用于信號通路或相關生物學過程，則認定該挖掘結果準確。

1 研究方法

1.1 數據來源

半枝蓮中天然化合物以及系統生物學數據主要來源于HIT、StringDB、DrugBank。其中天然化合物成分和靶點基因的信息從HIT中抽取，因為HIT數據是經過人工核驗的PubMed文獻信息，其靶點基因信息源于DrugBank[12]，并人工核驗確保數據準確性。因為復雜網絡算法準確性直接依賴基礎數據的質量，而StringDB整合了多個系統生物學數據源和文獻信息，數據全面并且質量高，所以本文PPIs蛋白質交互網絡信息從StringDB中抽取，選擇物種為人類。本文抽取人類PPIs蛋白質交互網絡中有17390個蛋白質節點，并且每個蛋白質節點有相應的標準基因名。基于更多的蛋白質節點數，可以更全面地挖掘與半枝蓮相關的系統生物學信息，以下為數據來源信息（表2）。

1.2 復雜網絡算法

Prince是以色列科學家Oron Vanunu設計的復雜網絡關聯分析算法，最初用于分析基因和疾病表型的關系[13]。通過整合中藥、天然化合物以及靶點基因信息，也可以將該算法用于中藥和基因的關系分析，本文基于Prince算法實現了Herb-Prince復雜網絡算法，計算中藥和基因關聯系數。算法輸入參數為半枝蓮、靶點基因以及人類PPIs蛋白質交互網絡，算法在人類PPIs蛋白質交互網絡進行迭代計算，通過蛋白質節點間關系權重，計算半枝蓮與蛋白質節點關聯系數，從而在網絡全局評估半枝蓮和每個節點的關聯強度。半枝蓮與每個節點的關聯系數用向量F表示，F的計算公式如下：

表1 半枝蓮主要天然化合物成分

表2 數據來源信息

1.3 基因族和KEGG信號通路分析

為了更加深入的理解半枝蓮藥理作用，本文通過基因族和KEGG信號通路進行富集分析。Prince算法選擇關聯系數最高的Top 100基因進行分析和驗證，本文采用相同的策略。首先，通過HGNC人類基因組數據庫平臺進行基因族分類[14]，HGNC平臺采用樹結構來劃分基因族，為每個基因族定義“根”符號，采用分級編號來區分子成員，如Caspases基因族，CASP是根符號，CASP1、CASP2、CASP3等成員為葉子節點。因為具有相似核苷酸或蛋白質序列的基因被歸為同一基因族，所以基因族成員一般在生化功能上具有相似性，分析關聯基因族能預測半枝蓮潛在作用的生物學過程。然后，通過KEGG信號通路分析平臺，獲得半枝蓮關聯信號通路信息，KEGG是日本京都大學建立了生物信息學數據庫[15]，將基因與細胞、物種和系統生物學功能關聯起來，其中Pathway數據庫整合了各種分子互動網絡信息，如細胞過程、新陳代謝、人類疾病、生物體系統等分子互動網絡，能全面地展示細胞和生物所包含的系統生物學信息，基于KEGG Pathway數據庫，可以挖掘半枝蓮潛在作用的人類分子互動網絡，為從分子水平分析半枝蓮的藥理活性提供線索。

2 研究結果

2.1 Herb-Prince算法結果

圖1 關聯系數百分位數分布情況

半枝蓮先驗靶點基因是AHSA1、BCL2L1、CASP3、PRKCG和TYR，基于這些先驗信息設置初始向量F，通過Herb-Prince算法進行計算，對計算結果進行分析，半枝蓮與各蛋白質節點的關聯系數取值范圍在[3.00E-06，4.07E-03]之間，均值為3.68E-04，篩選Top 100基因的閾值為1.655E-03（圖1）。

對蛋白質節點關聯系數降序排序，并將其轉換為標準基因名，得到Top 100基因（表3）。

2.2 基因族分析結果

通過HGNC分析有四個基因族被識別，每個基因族包含至少四個Top 100基因。四個基因族分別是Caspases、BIRC（Baculoviral IAP repeat containing）、TTC（Tetratricopeptide repeatdomain containing） 、PPI（Cyclophilin peptidylprolyl isomerases）（表4）。

由這四個基因族成員與6個先驗靶點基因在StringDB人類蛋白質交互網絡中的相關性可知（圖2），Caspases和BIRC基因族主要和BCL2L1和CASP3基因相關，基因AHSA1主要與TTC和PPI基因族相關。

Caspases基因族是一種半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡、壞死和炎癥中起著至關重要的作用[16]。BIRC基因族在細胞凋亡、細胞因子生成和染色體隔離中都有作用。TTC基因族所表達的TPRs的蛋白質涉及到多種的生物過程，如細胞周期調節、轉錄控制、線粒體和過氧化物酶蛋白傳輸、神經發生和蛋白質折疊。PPI基因族蛋白能與免疫抑制藥物環孢霉素綁定。如PPID蛋白能與環孢霉素結合，形成環孢霉素與蛋白復合體，以鈣調磷酸酶為靶點抑制T細胞信號通路。研究表明半枝蓮通過誘導腫瘤細胞凋亡達到抗腫瘤的作用[17，18]，而 Caspases和 BIRC 基因族都在細胞凋亡中起到了重要作用；同時有研究發現半枝蓮總黃酮能影響兩種腫瘤細胞線粒體[18，19]，TTC基因族成員基因和線粒體生物過程相關。未見直接文獻證實半枝蓮能調節PPI基因族成員，但有研究發現PPID基因是BCL2基因的協作者，可協同發揮凋亡作用[20]，已有研究表明半枝蓮能調節BCL2基因表達[17]，提示可以研究半枝蓮對PPID基因族的調節作用。

在以改善生存條件和促進轉型發展為特征的一系列試點示范基礎上,隨著我國經濟社會發展和社會福利改進需求的調整,我國可持續城市建設逐漸從關注生存環境、經濟轉型發展等議題向關注社會的公平、人的發展公平以及社會與環境的協同發展方向轉型,可持續城市關注的議題更加綜合，更注重人與社會、人與自然、社會與自然的協調發展。

表3 半枝蓮關聯Top 100基因

2.3 信號通路分析結果

通過KEGG平臺，挖掘先驗靶點基因信息和Top 100基因可能調節的信號通路，依據信號通路中關聯的基因數目篩選出半枝蓮Top 10信號通路（表5）。

2.3.1 Apoptosis信號通路

細胞凋亡是指為維持細胞的內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。研究發現從半枝蓮中提取的野黃芩素，可以誘導人類結腸癌細胞HCT116凋亡，野黃芩素可以提高細胞內ROS產出，提升HCT116細胞的CASP3基因活性，同時下調BCL2基因表達，并提高BAX基因表達水平[17]，CASP3基因是Apoptosis信號通路中的關鍵基因。研究者發現半枝蓮醇提物通過調節線粒體、Caspases和MAPK相關信號通路誘導人類胃腺癌細胞凋亡[18]。

表4 基因族信息

圖2 StringDB中先驗靶點基因與基因族成員之間的相關性

表5 Top 10 KEGG信號通路

2.3.2 Pathways in cancer信號通路

該信號通路整合了與癌癥有關的信號通路，如粘附、凋亡、血管內皮生長因子、線粒體等信號通路，并包括信號通路之間交互作用。而半枝蓮能抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成、增加機體免疫力、抗氧化、逆轉耐藥細胞株耐藥性、抑制端粒酶活性[4]。中醫臨床半枝蓮是一味治療各類癌癥重要藥材，常用于治療肝癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥。本課題組在研究國醫大師周仲英肺癌治療臨床醫案數據時，發現在2267例病案中半枝蓮出現1203次，占比45.1%；在所有病案中包含病機描述的有1090例，第一位病機為痰瘀郁肺的病案共有199例，半枝蓮出現161次，占比80-90%。還有研究者分析半枝蓮對不同腫瘤細胞的作用機制和抑制效果，如HCT-116[17]、MDAMB-231[21]、A549[22]、H460[22]、CL1-5[23]等腫瘤細胞。

2.3.3 Hepatitis B信號通路

半枝蓮歸肝經，半枝蓮可用于治療乙肝以及由慢性乙肝引發的肝癌[24]。半枝蓮在治療慢性乙肝中醫處方中出現的頻次很高，因為其有清熱解毒的功效。夏先福在臨床上用復方半蓮飲治療乙型肝炎50例，總有效率96%[25]。解長發運用中西醫結合治療乙肝105例，在中醫辨證時將病人分為濕熱型、脾虛型、脾虛肝郁型、脾腎虧虛型、肝腎陰虛型五種，其中前四種病人類型，在用藥方案中都有半枝蓮，因為半枝蓮藥用功效，并對乙肝病毒有抑制作用[26]。藥理學研究發現半枝蓮醇提液對Hep G 2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達有抑制作用，具有一定的抗乙肝病毒作用[27]。進一步研究發現九種半枝蓮天然化合物野黃芩苷、黃芩苷、檞皮素、黃芩黃素和漢黃芩素具有明顯的抗乙肝病毒作用[28]。并且半枝蓮總黃酮可誘導人類肝癌細胞MHCC97-H凋亡[19]。

2.3.4 PI3K-AKT信號通路

該信號通路在癌癥發展過程中起著非常重要，研究人員一直希望通過該信號通路尋求癌癥藥物治療新靶點。有研究發現半枝蓮可以抑制結直腸癌細胞HCT-8的遷移和入侵，作用信號通路有PI3K-AKT信號通路[29]。半枝蓮總黃酮具有抑制小鼠體內黑色素瘤生長的作用，抑制PI3K-AKT和mTOR信號通路相關蛋白表達水平，誘導腫瘤細胞自噬及凋亡[30]。

2.3.5 P53信號通路

P53信號通路在細胞DNA受到損傷時，P53信號通路能觸發細胞凋亡或修復。從半枝蓮中提取的野黃芩苷能通過P53信號通路抑制人類結直腸癌細胞增殖，誘導其凋亡[31]。半枝蓮醇提取物通過調節P53和AKT信號通路，抑制人類結腸癌細胞株增殖[32]。半枝蓮對表皮生長因子受體和P53信號通路的定向調控抑制非小細胞肺癌的生長[33]。半枝蓮多糖上調抑癌基因P53（TP53）以抑制胃癌細胞SGC-7901的生長活性[34]。

2.3.6 Focal adhesion信號通路

粘著斑激酶信號通路能影響細胞外基質粘附[35]。研究者發現半枝蓮對人肝癌細胞株HepG2細胞黏附產生影響，通過MTT法檢測各組細胞黏附情況，結果顯示半枝蓮組與空白組相比，半枝蓮組HepG2細胞黏附受到顯著抑制[36]。半枝蓮總黃酮可能通過改善細胞膜流動性，維持細胞膜的正常功能來發揮抗病毒感染作用[37]。在《中國藥典》中收錄的中醫名方養正消積方[38]，半枝蓮是組方中16味中藥之一，研究發現該方提取物DEM25能抑制FAK基因相關信號通路的磷酸化，影響腫瘤細胞和間皮細胞之間的粘連以及腫瘤細胞遷移，對腹膜轉移有抑制作用[39]。

2.3.7 InfluenzaA信號通路

Influenza A信號通路是與甲型H1N1流感相關。研究發現半枝蓮總黃酮對甲型H1N1流感病毒所致的小鼠感染及其導致的死亡表現了一定的治療或拮抗作用，并且其藥效表現了劑量相關特征[40]。相關研究提示半枝蓮總黃酮抗甲型H1N1流感病毒作用，可能與半枝蓮黃酮類成分抑制病毒對宿主細胞的吸附、抑制病毒復制早期階段病毒顆粒與細胞內涵體/溶酶體的融合，促進吸附病毒宿主細胞膜流動性恢復，維持細胞膜正常功能有關[40]。有專利申明半枝蓮總黃酮成分芹菜素，經體外細胞模型和體內動物模型試驗，具有很強抗流感病毒活性[41]。更早期研究發現芹菜素能抑制受感染細胞中流感病毒A/PR/8/34[42]。

2.3.8 其它信號通路

Amyotrophic lateral sclerosis信號通路，沒有直接臨床和藥理研究表明半枝蓮能調節該信號通路或相關疾病，但半枝蓮總黃酮對其它神經退行性疾病有一定的作用，如阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD），利用腦室注射Aβ25-35聯合三氯化鋁和RHTGF-β1建立擬AD大鼠模型，引起大鼠神經細胞線粒體凋亡通路中BCL2、BAX和CASP3基因異常表達，而半枝蓮總黃酮三個劑量能不同程度地逆轉復合Aβ25-35所致大鼠神經細胞異常改變，抑制細胞外β-淀粉樣蛋白（betaamyloids protein）沉積形成的老年斑（senile plaque）、抑制細胞內蛋白過度磷酸化形成的大量神經纖維纏結[43]。

Tuberculosis信號通路，有研究分析天然化合物對結核桿菌的抑制作用，發現12種天然化合物對結核桿菌的蛋白酶活性抑制率超過65%，其中有10種天然化合物屬黃酮類，包括半枝蓮中含有的黃芩黃素（抑制率84.03%）、黃芩苷（抑制率78.47%）[44]。

Toxoplasmosis信號通路，研究者分析了近30年天然化合物的抗弓形蟲能力，期望發現新的天然化合物用于治療弓形蟲感染，發現從黃芩中提取的黃芩黃素有很好的抗弓形蟲的特點，基于植物學分類方法半枝蓮歸于黃芩屬，同樣包含這種天然化合物[45]。有研究發現在體外實驗中純黃芩黃素能抑制弓形蟲的生長繁殖效果最好，中藥黃芩乙醇提取物效果次之[46]。

Small cell lung cancer信號通路，未發現有研究文獻提示半枝蓮調節該信號通路。中醫對疾病診斷有獨特的理論體系，并未采用西醫的方法對肺癌進行分類，半枝蓮是中醫肺癌治療的重要藥物，除周老在肺癌臨床組方中使用半枝蓮外，以廣東省中醫院劉偉勝教授在一年內門診接診的肺癌病例為研究對象，納入患者290例，并錄入290件病案處方，共有中藥148味，發現使用頻次最高的為半枝蓮（267次）[47]。有研究者通過藥理學方法分析半枝蓮對人肺巨細胞癌細胞株PG細胞BCL2基因表達的影響，發現經半枝蓮含藥血清處理后PG細胞BCL2基因表達明顯降低[48]。

3 討論

依據本文的文獻驗證方法，采用復雜網絡方法篩選出的KEGG信號通路，通過已有的臨床或藥理學研究進行驗證，10個KEGG信號通路有7個信號通路，有文獻證實半枝蓮或半枝蓮提取物能作用于信號通路或相應的生物學過程。其它信號通路雖然沒有直接文獻證實，但是也有文獻說明半枝蓮或天然化合物成分與這些信號通路或生物學過程有一定的相關性，提示半枝蓮潛在的藥理作用，對基因族的分析也獲得了相近的結論，篩選出的系統生物學信息能為中醫藥科研人員研究半枝蓮的作用機制提示潛在的方向。

在Top 100基因中，經過現代藥理學研究發現，這些基因或相關蛋白的表達可以被半枝蓮或提取物所調節，如TP53、BID、BAX、BCL2[49]、CASP9[18]、XIAP[50]。但是很多基因沒有直接的研究文獻提示半枝蓮或其提取物可能調節基因或相關蛋白的表達，如SPATA25基因是Top 1基因，SPATA25是精子形成相關基因，該基因在阻塞性無精子癥患者表達低于正常人群。中醫臨床用清毒消炎益腎湯對治療男性生殖道炎癥性不育癥300例取得了良好的效果，其基本方中包含半枝蓮[51]。用含半枝蓮的清精湯治療精漿AsAb陽性的免疫性不育患者，消除病因時能迅速改善精子發生的微環境，消除AsAb，消除精子凝集，較好地改善精子的各項參數，提高妊娠率[52]。雖然半枝蓮被用于治療炎癥性不育和免疫性不育，但是其機理未被進一步的闡釋。通過本文挖掘的系統生物學信息，提示研究人員從相關基因、基因族和信號通路分析半枝蓮對應的藥理活性機制。

在Top 100基因中有10個基因與Focal adhesion信號通路相關，其中PRKCB基因是鈣激活的，依賴于磷脂和二酰基甘油的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶，能對多種生物過程磷酸化水平有影響[53]。現有研究發現半枝蓮能抑制人肝癌細胞株HepG2細胞黏附性，并且含半枝蓮中醫名方能對FAK基因相關信號通路的磷酸化產生影響，結合已有研究和本文挖掘的信息可以推測半枝蓮能調節Focal adhesion信號通路中的PKC、SRC等節點（圖3）。

4 結論

本文利用復雜網絡方法，預測了與半枝蓮潛在關聯的基因，對相關基因家族和KEGG信號通路進行了富集分析，從系統生物學角度挖掘半枝蓮潛在作用機制，并通過文獻研究驗證分析結果。基于較少的先驗信息，本文所預測相關系統生物學信息與半枝蓮在中醫臨床運用和現代藥理研究高度一致，為進一步研究半枝蓮的作用機制提供幫助。

圖3 Focal adhesion信號通路