藏醫(yī)“白脈病療法”對腦缺血再灌注大鼠CD34、VEGF1、GAP-43蛋白表達(dá)的影響＊

2019-01-29 03:40:58李龍梅鄭麗娟祝日榮仁青加鄧志云李佳林武佳杰任小巧

世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化 2018年9期

李龍梅，鄭麗娟，祝日榮，毛萌，仁青加，鄧志云，李佳林，武佳杰，任小巧＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院北京 100029；3.西藏藏醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)藥研究所拉薩 850000）

近年來，腦損傷后機(jī)體的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制的研究逐漸深入，越來越多的研究結(jié)果表明，神經(jīng)再生是腦損傷后運(yùn)動功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。因此，尋找挖掘能有效增加神經(jīng)再生的醫(yī)療康復(fù)手段，同時配合常規(guī)的運(yùn)動和物理治療，將更加有助于腦卒中患者肢體運(yùn)動功能的恢復(fù)。本研究團(tuán)隊的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)白脈病療法對腦缺血大鼠腦組織有保護(hù)作用[1]，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗應(yīng)用免疫組化技術(shù)分別檢測了CD34蛋白、VEGF1蛋白、GAP-43蛋白在各組大鼠缺血再灌注后7天、14天兩個時間點(diǎn)的表達(dá)量，以此評價白脈病療法對于腦缺血大鼠的神經(jīng)和血管再生的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

雄性SD大鼠75只，清潔級（SPF），體重250±10 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。許可證號SCXK（京）2011-0004。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物房，飼養(yǎng)溫度20℃-24℃，正常飲食，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天。所有實(shí)驗動物的操作流程及飼養(yǎng)條件均符合實(shí)驗動物管理飼養(yǎng)條例，并遵循人道主義原則。

1.1.2 藥物、試劑和設(shè)備

如意珍寶丸（生產(chǎn)批號:20150116），購自金科藏藥股份有限公司；白脈軟膏（生產(chǎn)批號:130826），購自西藏奇正藏藥股份有限公司；辛伐他?。耗硸|制藥有限公司；（ZLI-9064）檸檬酸鹽緩沖液、（PV-9001）超敏型抗兔kit、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠抗VEGF單克隆抗體、兔抗GAP-43多克隆抗體，美國Abcam公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000 AB型），天津市泰斯特儀器有限公司；BX40型光學(xué)顯微鏡、E320型顯微照相機(jī)，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注模型制備

參照Belayev報道的線栓法加以改良后建立右側(cè)大腦中動脈栓塞缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。手術(shù)前1天禁食，自由飲水。缺血1.5 h后將漏在皮膚外的線栓拔出1 cm并剪斷，使大腦動脈Willis環(huán)和MCA恢復(fù)血供，造成缺血再灌注模型，保持體溫至清醒。造模后將動物置于放有清潔墊料的鼠籠內(nèi)，自由飲水、進(jìn)食。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線栓。手術(shù)過程中室溫保持在24-25℃。

1.2.2 分組與給藥

（1）分組：假手術(shù)組10只（Sham，S），其余55只動物于麻醉清醒后6 h時參照Zea Longa[8]5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，并以此評價、判斷模型是否成功。評分為1-3分的納入本研究。采用隨機(jī)表將每個分值的大鼠分配到4組，即模型組（model，M）；陽性對照組（positive control group，P）；如意珍寶丸組(Ruyizhenbao pills group，R)；白脈病療法組(Baimai therapy group，BT)，以此保證每組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分沒有顯著性差異。每組又分為缺血再灌注7d、14d兩個亞組。

（2）給藥：各組大鼠每天1次灌胃，并涂抹相應(yīng)的藥物，從造模后開始給藥至處死。如意珍寶丸組、白脈療法組灌胃給與如意珍寶丸混懸液，灌胃給藥量依據(jù)不同種類動物之間藥物劑量換算法為依據(jù)，按成人（70 kg計算）每日每公斤體質(zhì)量藥量的6.3倍計算，如意珍寶丸成人每天用量5片，每天2次，每片重0.5 g，折合計算得每100 g體重給藥約0.052 g，用生理鹽水配成0.052 g·ml-1的藥液，即每100 g體重灌胃1 mL藥液，按1 mL·100 g-1體重給予如意珍寶丸灌胃；陽性對照藥組灌胃給予辛伐他丁混懸液，成人每天用量辛伐他丁片以1 mL生理鹽水配0.01 mg的藥物配制，按1 mL·100 g-1體重給予辛伐他丁片灌胃。假手術(shù)組、模型組按1 mL·100 g-1體重給予生理鹽水灌胃（normal saline，NS），每天1次至處死；每組2個亞組給藥分別持續(xù)7天、14天。白脈病療法組在大鼠患肢涂白脈軟膏，每天2次，每次1 g并按摩5 min；假手術(shù)組、模型組和陽性對照組均于大鼠患肢涂凡士林。

1.2.3 指標(biāo)檢測：

（1）常規(guī)檢測：每天對各組大鼠皮毛狀態(tài)觀察并記錄；

（2）行為學(xué)檢測：分別與大鼠造模后3天、7天、14天，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，主要應(yīng)用“姿勢反射測驗（postural reflex test）”[2]。

（3）腦缺血大鼠腦組織病理學(xué)[1]

（4）免疫組化檢測CD34、VEGF1、GAP-43的表達(dá)情況。

取材:于造模成功后7天、14天取材，經(jīng)腹腔水合氯醛麻醉后斷頭取腦，每組取5只大鼠心臟灌注，沿胸骨左側(cè)剪開胸腔，從左心室進(jìn)針，插入到主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速滴入預(yù)冷生理鹽水（10 mL·min-1），無血污后改滴入4%多聚甲醛（5-10 mL·min-1），先快后慢，約250 mL，開顱取腦，4%多聚甲醛固定2天，石蠟包埋。

免疫組化SP法:石蠟包埋后進(jìn)行免疫組化，采用免疫組化SP法，具體流程如下：脫蠟、水化組織切片；0.01 mol·L-1PBS洗三次各2 min；組織切片置于枸櫞酸鹽微波修復(fù)抗原修復(fù)；用3%H2O2，室溫封閉10 min；PBS洗兩次各3 min；滴加一抗（CD34為1：100，GAP-43、VEGF1均為1∶200），4℃過夜（4℃過夜后次日組織需在37℃復(fù)溫45 min）。復(fù)溫，PBS沖洗2 min×3次；滴加超敏二步法免疫組化檢測試劑盒中的試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育10 min；PBS沖洗2 min×3次；滴加試劑2（辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物），37℃孵育10 min；PBS沖洗2 min×3次；DAB顯色：滴加DAB顯色劑顯色10 min(鏡下掌握顯色程度，若10 min顯色不足可適當(dāng)延長時間)；蒸餾水洗終止顯色反應(yīng)；酒精梯度脫水、二甲苯透明、封片、鏡檢。

從標(biāo)本中隨機(jī)取部分切片，用0.01 mol·L-1PBS代替一抗，其余步驟相同，作為陰性對照。

觀測指標(biāo)

CD34指標(biāo)的觀察位置：大鼠缺血側(cè)皮層CD34陽性細(xì)胞數(shù)。

VEGF1指標(biāo)觀測位置：每只動物隨機(jī)取免疫組化切片5張，在高倍鏡下（×200）計數(shù)大鼠皮層VEGF1陽性細(xì)胞，取其均值作為VEGF1陽性細(xì)胞數(shù)。

GAP-43指標(biāo)觀測位置：每只動物隨機(jī)取免疫組化切片5張，在高倍鏡下（×200）計數(shù)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞區(qū)內(nèi)1/3、顆粒下區(qū)GAP-43陽性細(xì)胞，取其均值作為海馬海馬齒狀回的顆粒下層（SGZ）的GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)。拍照定位參考《大鼠腦立體定位圖譜》。

表1 各組大鼠姿勢反射測驗（postural reflex test）比較(xˉ±s)

表2 不同時間點(diǎn)大鼠大腦皮層CD34在大腦皮質(zhì)的表達(dá)(xˉ±s)

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)資料使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用單因素方差分析，兩組間的比較采用LSD檢驗；若不符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗，以P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢測

每天對各組大鼠進(jìn)行皮毛觀測并記錄，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后前3天，各組大鼠毛發(fā)顏色差異不明顯，隨著缺血再灌注時間的增加，各組大鼠毛發(fā)狀態(tài)呈現(xiàn)差異，7天后開始明顯。具體為：白脈病療法組的大鼠毛色光澤度較好，色白，接近自然狀態(tài)，和假手術(shù)組沒有顯著性差異，與模型組及其他兩組治療組相比，好于這三組（M組、P組、R組）；如意珍寶丸組和陽性組沒有顯著性差異；模型組毛發(fā)情況最差，毛色枯黃成束狀。

2.2 行為學(xué)檢測

分別與大鼠造模后3天、7天、14天，對各組大鼠進(jìn)行“姿勢反射測驗（postural reflex test）”。姿勢反射測驗結(jié)果表明：術(shù)后第3天，缺血再灌注各組與假手術(shù)組相比，行為學(xué)評分均低于假手術(shù)組，P＜0.05；如意珍寶丸組和白脈病療法組大鼠的行為學(xué)評分高于模型組，P＜0.05；術(shù)后第7天，缺血再灌注各組與假手術(shù)組相比，行為學(xué)評分均低于假手術(shù)組，P＜0.05；白脈病療法組、如意珍寶丸組大鼠行為學(xué)評分高于模型組，有顯著性差異，；術(shù)后第14天，缺血再灌注各組與假手術(shù)組相比，行為學(xué)評分均低于假手術(shù)組，P＜0.05；白脈病療法組、如意珍寶丸組大鼠行為學(xué)評分高于模型組，P＜0.05（表1）。

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果

假手術(shù)組7天皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量多，核圓、大，偶見核固縮，14天與7天比較無明顯差異。模型組7天神經(jīng)元排列紊亂，部分細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核固縮，深染，周圍出現(xiàn)空泡，正常神經(jīng)元數(shù)量減少；14天見大量細(xì)胞溶解后殘留的痕跡，細(xì)胞稀疏，排列紊亂。陽性組7天神經(jīng)元排列疏松，偶見細(xì)胞核皺縮，深染；14天正常神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)一步減少，核固縮細(xì)胞增加，細(xì)胞間的空泡區(qū)域增多。7天如意珍寶丸組有少量核固縮細(xì)胞，與模型組相比明顯少，與假手術(shù)組相比沒有顯著差別；7天白脈病療法組有少量核固縮細(xì)胞，與模型組相比明顯較少，與假手術(shù)組相比沒有顯著差別；14天白脈病療法組核固縮細(xì)胞比7天多，但與模型組相比明顯少許多，有顯著性差異（圖1）。

2.4 CD34、VEGF1、GAP-43免疫組化檢測結(jié)果

2.4.1 CD34判定標(biāo)準(zhǔn)

任何被CD34抗體染成棕黃色細(xì)胞或細(xì)胞簇均可視為陽性表達(dá)，參照weidner法即與背景明顯分別的任何一個棕色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個血管，只要結(jié)構(gòu)不連續(xù)，分支結(jié)構(gòu)也可作為一個血管。每張染色切片先在低倍鏡下（×40）于腦缺血皮層尋找3個微血管密集區(qū)，隨后再在高倍鏡下（×200）下計算5個不同視野中的微血管數(shù)，取其均值作為本張片子CD34的值。免疫組化結(jié)果顯示，梗死區(qū)域幾乎沒有血管新生，新生的血管主要集中在缺血半暗帶中，血管形態(tài)扭曲并且不規(guī)則。術(shù)后7天、14天假手術(shù)組微血管有少量表達(dá)，術(shù)后7天、14天，白脈病療法組、如意珍寶丸組與模型組、陽性對照組比較微血管顯著增加，且有統(tǒng)計意義（P ＜ 0.05）（表2）。

2.4.2 VEGF1

腦缺血再灌注損傷后7天，如意珍寶丸組、白脈軟膏組、白療組三組大鼠腦缺血側(cè)皮層的VEGF1陽性細(xì)胞積分光密度高于假手術(shù)組、模型組和陽性組，且有顯著性差異（P＜0.05）；白脈病療法組、如意珍寶丸組VEGF1陽性細(xì)胞表達(dá)高于假手術(shù)組及模型組，且均有顯著性差異（P＜0.05）。14天各組VEGF1陽性細(xì)胞數(shù)較7天均有所下降，陽性組、如意珍寶丸組、白脈病療法組均高于假手術(shù)組和模型組與模型組。7天、14天，如意珍寶丸組VEGF1陽性細(xì)胞表達(dá)高于陽性對照組、白脈病療法組，且均有顯著性差異（P＜0.05）（表3）。

2.4.3 GAP-43

腦缺血損傷后7天，如意珍寶丸組、白脈病療法組GAP-43陽性細(xì)胞積分光密度與模型組、陽性對照組比較，均顯著增高，且有顯著性差異（P＜0.05），而如意珍寶丸組于白脈病療法組比較無顯著形成以；14天時如意珍寶丸組、白脈病療法組高于模型組、陽性對照組，且有顯著性差異（P＜0.05），而白脈病療法組GAP-43高于如意珍寶丸組，有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

3 討論

藏醫(yī)白脈病療法是臨床上治療腦卒中經(jīng)典治療方法，有研究證明本研究所選藥物在改善卒中患者肢體運(yùn)動功能方面具有較好療效[3]。本實(shí)驗從神經(jīng)血管再生角度觀察了藏醫(yī)白脈病療法對于缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用，從HE染色及神經(jīng)功能評分可以看出白脈病療法對腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。本研究又從CD34、VEGF1、GAP-43的表達(dá)情況對其作用機(jī)理的進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。

以往認(rèn)為成年后大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)停止增生，但動物實(shí)驗證明局灶性缺血后有新的血管生成。毛細(xì)血管生成在腦卒中后2-7天會于缺血灶邊緣區(qū)開始出現(xiàn)，這些血管早期表現(xiàn)是梗死灶邊緣區(qū)的大管徑薄壁血管，然后（腦卒中后2-28天）這些薄壁血管通過發(fā)芽和分枝形成小血管，并逐漸進(jìn)入梗死灶[4]，從而有利于神經(jīng)功能的再塑。諸多研究表明，腦組織血管密度高的缺血性腦血管病患者預(yù)后明顯好于血管密度低的患者，缺血區(qū)腦組織的血管新生可明顯改善缺血區(qū)周圍的組織灌流，彌補(bǔ)血流量下降導(dǎo)致的腦損傷，促使神經(jīng)功能盡可能恢復(fù)。CD34在維持此動態(tài)平衡中起著重要的作用，在缺血缺氧等因素可降低CD34數(shù)量并破壞其功能，使內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，最終造成組織缺血[5]。CD34減少的程度已被用來評價內(nèi)皮細(xì)胞功能受損的程度。本研究顯示，術(shù)后7天白脈病療法組、如意珍寶丸組較模型組比較，CD34表達(dá)顯著增加；術(shù)后14天，白脈病療法組、如意珍寶丸組與模型組、陽性對照組比較，CD34表達(dá)量均明顯增加，同時14 d時白脈病療法組與如意珍寶丸組比較，明顯較高，有顯著差異，說明白脈病療法組在促進(jìn)CD34蛋白表達(dá)方面較單純應(yīng)用如意珍寶丸治療有明顯的時間相關(guān)性，同時也說明綜合治療手段比單純應(yīng)用某種藥物治療更具有優(yōu)勢。

表3 不同時間點(diǎn)大鼠皮層VEGF1陽性細(xì)胞積分光密度(xˉ±s)

表4 不同時間點(diǎn)大鼠SGZ區(qū)GAP-43陽性細(xì)胞積分光密度(xˉ±s)

血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，具有促進(jìn)血管形成的作用[6，7]本實(shí)驗選擇Anti-VEGF antibody[VG-1]（ab1316）來檢測各治療組對于血管再生的調(diào)節(jié)作用，其可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管透化作用。本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注7天、14天時，如意珍寶丸、白脈病療法治療組均可以提高大鼠腦缺血后梗死區(qū)的VEGF1的表達(dá)，如意珍寶丸組作用最明顯，此結(jié)果與14天時CD34的陽性表達(dá)反應(yīng)白脈病療法組優(yōu)于如意珍寶丸組的結(jié)果有些不一致，可能因為，一是如意珍寶丸的作用主要在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的功能而發(fā)揮作用，而白脈病療法屬于綜合治療，其作用的發(fā)揮可能有更多的途徑；二是實(shí)驗例數(shù)較少，在統(tǒng)計學(xué)上未能反應(yīng)出白脈病療法綜合治療在改善VEGF1表達(dá)上的優(yōu)勢，需要進(jìn)一步研究。

生長相關(guān)蛋白（GAP-43）在神經(jīng)組織中廣泛存在，是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，它是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高，研究表明其主要參與神經(jīng)細(xì)胞外生長，突觸發(fā)育的形成和神經(jīng)細(xì)胞的再生[8]，所以可以被用作軸突生長的標(biāo)記物。GAP-43在正常腦組織亦有一定量的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布于大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層、齒狀回顆粒細(xì)胞下層（subgranular zone，SGZ）、門區(qū)等[9]。本實(shí)驗主要分析海馬齒狀回GAP-43陽性細(xì)胞，陽性神經(jīng)細(xì)胞多呈顆粒狀。研究表明，7天、14天時如意珍寶丸組、白脈病療法組GAP-43陽性表達(dá)均明顯高于模型組、陽性對照組，而7天時如意珍寶丸組與白脈病療法組比較無顯著性；至14天時白脈病療法組GAP-43高于如意珍寶丸組，說明白脈病療法綜合治療方法在促進(jìn)神經(jīng)的再生方面明顯優(yōu)于單純的藥物治療方法。

總之，白脈病療法可促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠GAP-43、VEGF1、CD34的陽性表達(dá)，促進(jìn)微血管增生，說明腦缺血可誘導(dǎo)側(cè)支循壞的建立和微血管網(wǎng)的再建，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

附錄