藏藥訶子化學成分的高效液相色譜-質譜聯用技術快速鑒定研究＊

簡 平，亓 旗，周 坤，梁文儀，梁林金，葉 婷，張蘭珍

（北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488）

訶子是使君子科植物訶子Terminalia chebular Retz.及其變種絨毛訶子Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果實。別名訶黎勒、訶梨，藏醫、蒙醫稱“阿如拉”，泰語稱“麻菜果”，原產于印度、緬甸，在我國云南、廣東、廣西、西藏等地也有分布。具有澀腸止瀉，斂肺止咳，降火利咽之功效[1]。訶子主要含有鞣質、酚類、苯丙素類、黃酮和三萜類等多種化學成分，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤等作用[2]。目前尚未有液質聯用鑒定分析訶子中化學成分的報道。

本研究首次采用高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-LTQ-Orbitrap MS）對訶子提取物中化學成分進行在線分離分析研究，根據其分子離子以及特征碎片離子的精確質荷比，結合標準品、文獻數據[3-13]等方法鑒定訶子提取物中的化學成分，并對它們可能的質譜裂解模式進行歸納，以期對訶子的質量控制、藥效物質基礎及化學成分的快速鑒定提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LTQ-Oribitrap XL線性離子阱-串聯靜電場軌道阱質譜儀：美國Thermo Scientific公司產品，配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1化學工作站（美國thermo公司）；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色譜系統：含二元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，DAD檢測器；Chromeleon 7工作站。Millipore Synergy UV型超純水機（美國Millipore公司）；Sartorious BT 25S型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W）；0.22 μm微孔濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）；甲醇（質譜純，Fisher公司）；乙酸（色譜純，天津市豐越化學品有限公司）。

圖1 訶子提取物的總離子流圖（負離子模式）

訶子藥材產于西藏，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實；沒食子酸（批號141109）購于成都普菲德生物技術有限公司、沒食子酸甲酯（批號160105）購于北京四面體生物科技有限公司、柯里拉京（批號MUST — 1051301）、鞣花酸（批號MUST — 15091807）均購于成都曼思特生物科技有限公司、訶子鞣酸（批號Z06D5B2）購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.2%醋酸的水溶液(A)，甲醇溶液(B)；梯度洗脫條件：0-10 min(5%-15%B)，10-15 min(15%-25%B），15-30 min(25%-30%B)，30-50 min(30%-60%B)，50-55 min(60%-90%B)，55-62 min(90%-90%B)；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm。

1.2.2 質譜條件

HESI離子源，負離子檢出模式，離子源溫度350℃，電離源電壓4 KV，毛細管電壓：35 V，管透鏡電壓：110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99.99%），鞘氣流速：40 arb，輔助氣流速：20 arb；數據采用傅里葉變換高分辨全掃方式（TF，Full scan，Resolution 30000）數據依賴性（data-dependent acquisistion）ddMS2和ddMS3；母離子列表（Parent ion list）PIL-MS2和PIL-MS3；并運用CID和HCD（高能量碰撞）相結合的碎解方式等多種策略。

1.2.3 供試品溶液的制備

稱取訶子藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50%甲醇20 mL，超聲提取50 min，靜置冷卻，補足原重量。搖勻，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.4 對照品溶液的制備

精密稱定對照品沒食子酸2.1 mg，沒食子酸甲酯2.1 mg，柯里拉京2.0 mg，訶子鞣酸2.1 mg，置 10 mL量瓶中加甲醇溶解，定容，搖勻。精密稱定鞣花酸對照品2.3 mg，置10 mL量瓶中加DMSO溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液。

2 結果

按照1.2節方法分析訶子提取物，由于訶子所含化學成分主要為酚酸、可水解鞣質、黃酮等酸性化合物，選擇負離子模式，得到其在負離子模式下的總離子流圖（圖1）。根據檢測得到的各化學成分保留時間、精確質譜信息，并結合提取離子流圖與標準品信息、Scifinder數據庫及相關文獻對其進行成分確認，共鑒定了62個成分，包括60個酚酸和鞣質，2個三萜類（峰61，62）。其中，通過與對照品比對鑒定的化學成分有：沒食子酸（gallic acid）、沒食子酸甲酯（methyl gallate）、柯里拉京（corilagin）、訶子鞣酸（chebulagic acid）、鞣花酸（ellagic）acid。峰5，19，20，26，31，34，35，38，44，45，51，53，55和峰59為首次從藏藥訶子中發現。詳情列于（表1）。

2.1 酚酸類化合物鑒定

1號峰保留時間為2.91 min，其分子離子峰為m/z 191[M—H]—，該離子失去一個中性碎片H2O（18u）產生碎片離子m/z 173[M-H—H2O]—，失去一個中性碎片CO（28u）和2個H2O（18u）產生碎片離子 127[M —H—CO—2H2O]—。根據元素組成分析，推測分子式為C7H12O6，相對分子質量理論值為191.0550，實測值為191.0554。1 號峰被推測為 quinic acid[14，15]。

表1 訶子提取物中的主要化學成分

續表1

2號峰保留時間為3.46 min，其分子離子峰為m/z 173[M—H]—，失去一個中性碎片H2O（18 u）產生碎片離子m/z 155[M—H—H2O]—。根據元素組成分析，推測分子式為C7H10O5，相對分子質量理論值為173.0444，實測值為173.0450。2號峰被推測為Shikimic acid[5]。

通過標準品比對，結合文獻數據[14，17]，峰9和60被鑒定為gallic acid和ellagic acid。gallic acid分子離子峰為m/z 169[M—H]—，gallic acid失去一個中性碎片CO2(44 u)產生碎片離子m/z 125[M—H—CO2]—。根據元素組成，其分子式為C7H6O5，相對分子質量理論值為169.0131，實測值為169.0138；ellagic acid的分子離子峰為m/z 301[M—H]—，特征碎片離子m/z 603[2M— H]—，ellagic acid失去一個中性碎片 H2O（18 u）產生碎片離子m/z 283[M—H—H2O]—，m/z 257[M-HCO2]—為其失去一個中性碎片CO2（44 u）產生的碎片離子。根據元素組成，推測分子式為C14H6O8，相對分子質量理論值為300.9979，實測值為300.9984。

2.2 簡單沒食子酰酯類化合物鑒定

簡單沒食子酰類化合物，其特征碎片離子源于失去沒食子酰基部分(-galloyl，-152 u)而產生。以54號峰為例，保留時間為38.61 min，其分子離子峰為m/z 939[M—H]—，依次失去一個沒食子酰基(152 u)，從而形成的系列碎片離子有：m/z 787[M—H—galloyl]-，m/z 635[[M—H—2galloyl]-，m/z 483[M—H—3galloyl]-，m/z 331[M—H—4galloyl]-，m/z 179[M—H—5galloyl]-。根據元素組成，推測分子式為C41H32O26，相對分子質量理論值為m/z 939.1098，實測值為m/z 939.1105。54號峰被推測為pentagalloylglucose。

39，46，47 ，49和52號峰的保留時間分別為23.81min，32.02 min，32.85 min，34.90 min和35.80 min，其分子離子峰均為m/z 787[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C34H28O22，相對分子質量理論值為m/z 787.0988，39號峰實測值為m/z 787.0994，峰46實測值為m/z 787.0995，47號峰實測值為m/z 787.0991，49號峰實測值為m/z 787.1004，52號峰實測值為m/z 787.1002。根據其依次失去一系列沒食子酰基，結合簡單沒食子酰類化合物的特征碎片，39，46，47，49和52號峰被推測為tetragalloylglucose及其同分異構體；36，40，42號峰的保留時間分別為22.35，24.11和24.90，其分子離子峰均為m/z 635[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C27H24O18，相對分子質量理論值為635.0879，36號峰實測值為635.0883，40號峰實測值為635.0886，42號峰實測值為635.0880。根據簡單沒食子酰類化合物的特征碎片，被推測為triglloylglucose及其同分異構體。

13，15，17 ，22-24，27，28，30，33號峰的保留時間分別為 11.80 min，14.10 min，14.60 min，16.22 min，17.21 min，17.54 min，18.81 min，19.07 min，19.51 min和20.80 min，其分子離子峰為m/z 483[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C20H20O14，相對分子質量理論值為m/z 483.0769，13號峰實測值為m/z 483.0785，15號峰實測值為m/z 483.0782，17號峰實測值為m/z 483.0784，22號峰實測值為m/z 483.0776，23號峰實測值為m/z 483.0778，24號峰實測值為m/z 483.0778，27號峰實測值為m/z 483.0785，28號峰實測值為m/z 483.0779，30號峰實測值為m/z 483.0778，33號峰實測值為m/z 483.0785。結合簡單沒食子酰類化合物的特征碎片，被推測為digalloylglucose及其同分異構體。

6，8，11 號峰的保留時間分別為6.84 min，8.28 min和9.98 min，其分子離子峰為m/z 331[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C13H16O10，相對分子質量理論值為m/z 331.0660，6號峰實測值為m/z 331.0666，8號峰實測值為m/z 331.0668，11號峰實測值為m/z 331.0667。結合簡單沒食子酰類化合物的特征碎片，被推測為 glucogallin 及其同分異構體[14，17，18]。以 glucogallin為例，說明簡單沒食子酰酯類化合物的裂解方式：m/z 331[M—H]-為其分子離子峰，失去一個中性碎片C4H8O4(120 u)產生碎片離子m/z 211[M—H—C4H8O4]—，失去一個沒食子酰基(152 u)產生碎片離子m/z 179[M—galloyl]—，失去一個中性碎片C6H10O5(162 u)產生沒食子酸碎片m/z 169[M—H—C6H10O5]—，失去一個中性碎片C6H10O5的基礎上，再失去一個中性碎片CO2(44 u)產生碎片離子m/z 125[M—H—C6H10O5— CO2]—。

32號峰的保留時間為19.82 min，其分子離子峰為m/z 183[M—H]—，失去一個CH3（15u）中性碎片形成碎片離子m/z 168[M—H—CH3]—，再失去一個CO2（44u）形成碎片離子m/z 124[M—H—CH3-CO2]—。根據元素組成，推測其分子式為C8H8O5，相對分子質量理論值為m/z 183.0288，實測值為m/z 183.0296。峰32被鑒定為methyl gallate，這與其標準品碎裂信息一致。

2.3 鞣質類化合物鑒定

鞣花鞣質由于其結構中具有HHDP部分，碎片離子m/z 301是其典型特征。5，19，43號峰的保留時間分別為6.45 min和25.55 min，其分子離子峰為m/z 633[M—H]—和m/z 1267[2M—H]—，失去一個沒食子酰基產生碎片離子m/z 481[M—H—galloyl]—，繼續失去一個H2O（18u）產生碎片離子m/z 463[M—H—galloyl—H2O]—。根據元素組成，推測其分子式為C27H22O18，相對分子質量理論值為m/z 633.0722，峰5實測值為m/z 633.0728，19號峰實測值m/z 633.0726，峰43實測值m/z 633.0723。該化合物失去332 u形成m/z 301(HHDP)碎片離子，這表明其結構中含有一個galloylglucose(332 u)單元。因此5，19，43號峰被鑒定為galloyl—HHDP—glucose及其異構體[16，19]，進一步與對照品比較，43號峰被鑒定為corilagin。

圖1 訶子鞣質類部分化合物結構圖

20，26，31 和55號峰的保留時間分別為15.30 min，18.85 min和19.64 min，38.90 min，分子離子峰為m/z 785[M—H]—，該離子連續失去沒食子酰基產生碎片離子m/z 633[M—H—galloyl]—、m/z 481[M—H—2galloyl]—，繼續失去一個中性碎片H2O（18u）產生碎片離子m/z 463[M—H—2galloyl—H2O]—。根據元素組成，推測其分子式為C34H26O22，相對分子質量理論值為m/z 785.0832，20號峰實測值為m/z 7785.0841，26號峰實測值為m/z 7785.0839，31號峰實測值為m/z 785.0831，55號峰實測值為m/z 785.0842。結合特征碎片離子m/z 300(HHDP)，20，26，31和55號峰被推測為digalloyl—HHDP—glucoses[23]。然而僅憑MS，MS/MS和UV等手段，仍無法區分tercatain及其同分異構體。

34號峰的保留時間為21.24 min，分子離子峰為m/z 951[M—H]—，該離子失去一個中性碎片H2O（18u）產生碎片離子m/z 933[M—H—H2O]—。根據元素組成，推測其分子式為C41H28O27，相對分子質量理論值為m/z 951.0734，實測值為m/z 951.0736。結合文獻數據與特征碎片m/z 301[21]，34號峰被推測為geraniin。

3號峰，分子離子峰為m/z 481[M—H]—，失去一個葡萄糖產生碎片離子m/z 301(HHDP)。根據元素組成，推測其分子式為C20H18O14相對分子質量理論值為m/z 481.0613，實測值為m/z 481.0623。3號峰被初步推測為HHDP—glucose。14和21號峰的保留時間分別為12.02 min和15.38 min，分子離子峰為m/z 1083[M—H]—，失去一個鞣花酸單元產生碎片離子m/z 781[M—H—ellagic acid]—，繼續失去一個葡萄糖產生碎片離子m/z 601[M—H—ellagic acid—glu]—。根據元素組成，推測其分子式為C48H28O30，相對分子質量理論值為m/z 1083.0582，14號峰實測值為m/z 1083.0571，21峰實測值m/z 1083.0569。結合特征碎片離子m/z 541[M— 2H]2—、m/z 301(DPPH)，14和21號峰被推測為punicalagin。反相色譜中，α—punicalagin比β—punicalagin先出峰。所以14號峰被推測為α—punicalagin，21號峰被推測為為β—punicalagin。對應于punicalagin的裂解碎片m/z 781[M—H—ellagic acid]—，7和10號峰的分子離子峰為m/z 781[M—H]—，保留時間分別為7.82 min和8.28 min，失去一個葡萄糖碎片產生碎片離子m/z 601[M—H—glu]—。根據元素組成，推測其分子式為C34H22O22，相對分子質量理論值為m/z 781.0519，7號峰實測值為m/z 781.0526，峰10實測值m/z 781.0523。結合碎片離子m/z 301(DPPH)，7和10號峰被推測為punicalin及其同分異構體[20]。

16和18號峰的保留時間分別為14.39 min和14.76 min，分子離子峰為m/z 783[M—H]—，結合文獻數據[22]，特征碎片離子有m/z 391[M — 2H]2—，m/z 631，m/z 451，m/z 299。根據元素組成，推測其分子式為C34H24O22，相對分子質量理論值為m/z 783.0675，16號峰實測值為m/z 783.0674，18號峰實測值為m/z 783.0681。16和18號峰初步推測為terflavin B及其異構體。25號峰在保留時間15.43—18.41 min范圍內出現了一個寬峰，表明其可能由幾個同分異構體組成，分子離子峰為m/z 1085[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C48H30O30，相對分子質量理論值為m/z 1085.0738，25號峰實測值為m/z 1085.0732，結合文獻數據[22]，25號峰被初步推測為terflavin A。

m/z 337[Chebulic acid—H—H2O]—是訶子次鞣質類化合物的特征碎片，是由訶子次鞣質的基本結構單元訶子次酸(Chebulic acid)分子內失去一個中性碎片H2O形成，該類化合物的特征碎片還有m/z 319[Chebulic acid— H — H2O — H2O]—，m/z 293[Chebulic acid—H — H2O-CO2]—，m/z 275[Chebulic acid— H — H2O— H2O — CO2]—。

35和38號峰的保留時間分別為21.68 min和23.33 min，分子離子峰為m/z 971.10[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C41H32O28，相對分子質量理論值為m/z 971.0996，35號峰實測值為m/z 971.1001，38號峰實測值為m/z 971.1005，結合特征碎片離子m/z 953[M — H — H2O]—，m/z 935[M — H — 2H2O]—，m/z 467[M—2H—2H2O]2—，初步推測其為neochebulagic acid及其異構體[19]。

44號峰的保留時間為27.91 min，分子離子峰為m/z 989[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C41H34O29，相對分子質量理論值為m/z 989.1102，實測值為m/z 989.1109。結合特征碎片離子m/z 494[M—2H]2-，m/z 337。峰44被推測為chebuloyl neochebuloyl galloylglucose[19]。

45和51號峰的保留時間為29.02 min和35.30 min，分子離子峰為m/z 803[M—H]—，該離子失去一個中性碎片沒食子酸后產生碎片離子m/z 633[M—H—gallic]—，該離子失去一個沒食子酰基產生碎片離子m/z 651[M-H-galloyl]—，繼續失去一個沒食子酸中性碎片形成m/z 481[M—galloy—gallic]—。根據元素組成，推測其分子式為C34H28O23，相對分子質量理論值為m/z 803.0938，45號峰實測值為m/z 803.0944，51號峰實測值為m/z 803.0945。結合其特征離子m/z 337，m/z 319，m/z 293，m/z 275，m/z 401[M — 2H]2—，45和51號峰被推測為digalloyl—chebuloyl—glucose及其同分異構體[22]。

53號峰的保留時間為37.67 min，分子離子峰為m/z 973[M—H]—，連續失去沒食子酰基產生碎片離子m/z 821[M — H — galloy]—、m/z 669[M — H — 2galloy]—、m/z 517[M—H—3galloy]—，失去一個沒食子酰后繼續失去一個沒食子酸中性碎片產生碎片離子m/z 651[M—H—galloy—gallic]—。根據元素組成，推測其分子式為C41H34O28，相對分子質量理論值為m/z 973.1153，實測值為m/z 973.1148。結合特征碎片m/z 337，53號峰被推測為neochebulinic acid。

圖2 訶子鞣質類、酚酸類部分化合物結構圖

48和59號峰的保留時間分別為34.04 min和43.35 min，分子離子峰為m/z 953[M—H]—，該離子失去一個羧基形成碎片離子m/z 454[M—H—COOH]2-。根據元素組成，推測其分子式為C41H30O27，相對分子質量理論值為953.0891，48號峰實測值為953.0881，59號峰實測值為953.0898。根據文獻數據結合特征離子有 m/z 476[M — 2H]2—，m/z 633，m/z 463，m/z 300(DPPH)，二者初步被鑒定為galloyl chebuloyl—HHDP-glucose[17，19]，進一步與標準品對比，48 號峰被鑒定為chebulagic acid。

峰4和12的保留時間為5.26 min和10.80 min，分子離子峰為m/z 355[M—H]—。依據特征離子m/z 337[M—H—H2O]—、m/z 711[2M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C14H12O11，相對分子質量理論值為m/z 355.0296，峰4實測值為m/z 355.0292，峰12實測值為m/z 355.0302。因此4和12號峰被初步鑒定為chebulic acid及其異構體[17，19]。峰37，保留時間為 23.15 min，分子離子峰為m/z 683[M—H]—，失去一個沒食子酸中性碎片產生碎片離子m/z 513[M—H—gallic]—，失去一個沒食子酰基后產生碎片離子m/z 531[M—H—galloyl]—，繼續失去一個沒食子酸中性碎片產生碎片離子m/z 351[M—H—galloyl—gallic]—。根據元素組成，推測其分子式為C28H28O20，相對分子質量理論值為m/z 683.1090，實測值為m/z 683.1096。因此，峰37被初步推測為 methyl neochebulanin[16，19]。

29和41號峰的保留時間分別為19.40 min和24.60 min，分子離子峰為m/z 651[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C27H24O19，相對分子質量理論值為m/z 651.0828，實測值為m/z 651.0828。結合特征碎片離子m/z 633[M—H—H2O]—，29和41號峰被初步推測為chebulanin及其同分異構體。

50號峰的保留時間為35.09 min，分子離子峰為m/z 985[M—H]—，失去一個CH2（14u）中性碎片產生碎片離子m/z 971[[M—H—CH2]—，失去一個沒食子酸中性碎片和沒食子酰基后產生碎片離子m/z 633[M—galloy—gallic]—。根據元素組成，推測其分子式為C42H34O28，相對分子質量理論值為m/z 985.1153，50號峰實測值為m/z 985.1148。結合文獻數據和特征碎片離子m/z 492[M — 2H]2—，m/z 351[methyl neochebulate—H—H2O]—，50號峰被推測為methyl neochebulagate及其同分異構體[22]。

56和57號峰的保留時間分別為40.23 min和40.97 min，分子離子峰為m/z 987[M—H]—。根據元素組成，推測其分子式為C42H36O28，相對分子質量理論值為m/z 987.1309，實測值為m/z 987.1308。依據文獻數據和特征碎片m/z 973[M—H—CH2]—，m/z 493[M—2H]2—，m/z 351[methyl neochebulate— H — H2O]—，56和57號峰被推測為methyl neochebulinate及其同分異構體[22]。

58號峰的保留時間為41.32 min，分子離子峰為m/z 955[M—H]—，連續失去沒食子酰基產生碎片離子m/z 803[M — galloyl]—、m/z 651[M — 2galloyl]—、m/z 499[M—3galloyl]—，失去3個沒食子酰基后繼續失去一個葡萄糖產生碎片離子峰m/z 319[M—3galloyl—glu]-。根據元素組成，推測其分子式為C41H32O27，相對分子質量理論值為m/z 955.1047，實測值為m/z 955.1030。因此，58號峰被推測為chebulinic acid[17]。

2.5 三萜類化合物鑒定

在負離子模式下，61和62號峰其分子離子峰為m/z 503[M—H]—，該離子脫去CO2（14u）形成碎片離子m/z 459[M-H-CO2]—。根據元素組成分析，兩者分子式為C30H48O6，相對分子質量理論值為m/z 503.3367，實測值為m/z 503.3378和m/z 503.3373。盧普平等人從訶子乙醇提取物中分離得到的三萜類化合物有arjungenin，分子式均為C30H48O6，其相對分子質量為m/z 503.3367，與所測數據一致，因此初步推測61和62號峰為arjungenin及其同分異構體。

3 總結與討論

本實驗采用HPLC—MS技術對訶子提取物的化學成分進行研究，通過高分辨質譜中精確分子質量歸屬出元素組成，分析裂解碎片信息，結合標準品信息及相關文獻共鑒定出62種化學成分，主要為可水解鞣質類。其中，14個化合物為首次從訶子中鑒定得到。分析了已鑒定化合物的質譜碎裂途徑，推測出酸類和可水解鞣質類化學成分的質譜裂解規律，可為中藥化學成分及其類似物質的結構解析提供參考。