基于總鞣質(zhì)和7種成分同時測定的訶子藥材質(zhì)量控制研究＊

梁林金，亓 旗，葉 婷，梁文儀，周 坤，簡 平，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

訶子為使君子科欖仁樹屬植物訶子Terminalia chebular Retz.及其變種絨毛訶子Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果實[1]，又名訶黎勒，訶黎等。在藏醫(yī)藥中，訶子的使用頻率幾與漢醫(yī)方劑中甘草相等[2]。在我國主要分布于西南等地區(qū)、如西藏、云南、廣東和廣西等地。訶子含有多酚、可水解鞣質(zhì)、甾醇、黃酮和三萜等化合物[3-10]，其中鞣質(zhì)是其主要成分之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，訶子提取物及單一成分都表現(xiàn)出良好的抗氧化，抗病原微生物，保肝，減毒，降血糖，抗腫瘤和抗炎等生物活性[11-15]。

文獻(xiàn)報道的訶子質(zhì)量研究有比色法與指紋圖譜法相結(jié)合的質(zhì)控研究，HPLC同時測定訶子沒食子酸、訶子次酸、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶子鞣酸、鞣花酸和五沒食子酰葡萄糖7種成分含量方法[16，17]。本實驗建立了可見分光光度法測定訶子藥材總鞣質(zhì)含量及HPLC同時測定12個不同批次訶子藥材中沒食子酸、安石榴苷A、沒食子酸甲酯、安石榴苷B、柯里拉京、五沒食子酰葡萄糖和鞣花酸7種成分含量的方法，其中3個成分安石榴苷A、沒食子酸甲酯、安石榴苷B為首次在訶子藥材中同時測定，為訶子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

紫外-可見分光光度計：TU1810（普析通用公司）（尤尼科UV-2000）；SartoriousBT25S型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；LC-1100型高效液相色譜儀（安捷倫公司），DAD紫外檢測器；超聲波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W），AK-400A粉碎機(jī)（溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司）。

對照品沒食子酸(MUST-17022801)、安石榴苷（MUST-17030501）、柯里拉京（MUST-17033002）、五沒食子酰葡萄糖（MUST-17060201）、鞣花酸（MUST-17052603），純度均大于99%，購于成都曼斯特科技有限公司；沒食子酸甲酯（TN1127CA14），純度大于98%，購于上海源葉生物科技有限公司。鎢酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠），鉬酸鈉（天津市化學(xué)試劑四廠），硫酸鋰（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），干酪素（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），鹽酸（西隴科學(xué)股份有限公司），磷酸（西隴科學(xué)股份有限公司）。水為超純水，磷酸、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。訶子藥材分別購自北京市藏醫(yī)院、安徽亳州藥材市場和河北安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為使君子科植物訶子Terminalia chebular Retz.的干燥成熟果實，存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系。

2 方法與結(jié)果

2.1 總鞣質(zhì)含量測定（藥典法[18]）

2.1.1 溶液配制

磷鉬鎢酸試液：按2015版藥典第4部方法：取鎢酸納100 g、鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g、水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)，冷卻，加水稀釋至1000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色（如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多余的溴）。

29%碳酸納溶液：取10.8 g無水碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水。

對照品溶液的制備：取沒食子酸對照品約5 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液制備：分別取3份訶子藥材粉末（西藏，50目）0.1 g，精密稱定，加入50 mL 60%乙醇，稱重，50℃溫浸12 h，放冷，補(bǔ)足失去重量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

顯色方法：供試液2 mL置25 mL容量瓶中，加入1 mL磷鉬鎢酸試液，再加去離子水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長處測定吸光度。

2.1.2 線性關(guān)系的考察

精密吸取沒食子酸對照品溶液（0.054mg·mL-1）0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL分別置25 mL容量瓶中，各加入1 mL磷鉬鎢酸試液，再分別加入去離子水11.5 mL，11 mL，10.5 mL，10 mL，9 mL，8 mL，7 mL，用 29%的 Na2CO3溶液定容，按“2.1.1”法顯色，760 nm測定吸光度，計算回歸方程：Y=102.1469X+0.0087，r=0.9982(n=6)。結(jié)果表明，沒食子酸在1.08-10.08 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.1.3 顯色穩(wěn)定性考察

精密吸取干酪素吸附前后的樣品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.1.1”項顯色，每隔10 min測定一次吸光度。結(jié)果顯示顯色20 min后穩(wěn)定，在120 min之內(nèi)溶液吸附前后吸光度的RSD值分別為0.634%和0.909%。在顯色穩(wěn)定時間為20-120 min。

2.1.4 干酪素用量的考察

精密吸取供試品溶液25 mL，加入不同用量的干酪素（0.6 g，0.8 g，1 g，1.2 g，1.4 g），進(jìn)行總鞣質(zhì)總含量測定。結(jié)果顯示加入1.2 g干酪素測定鞣質(zhì)的含量較穩(wěn)定，即：100 mg原藥材需干酪素1200 mg。

2.1.5 精密度考察

精密吸取干酪素吸附前后的供試品溶液各2 mL置于25 mL容量瓶中，顯色后連續(xù)測定吸光度6次。根據(jù)測得的吸光度值計算吸附前后的RSD分別為0.369%和0.478%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察

取供試品溶液6份，按“2.1.9”項測定吸光度，計算總鞣質(zhì)含量為39.314%，RSD為1.00%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取訶子供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h按“2.1.9項”測定吸光度，計算總鞣質(zhì)含量。結(jié)果顯示在8小時內(nèi)總鞣質(zhì)含量穩(wěn)定，RSD為0.43%。

2.1.8 藥材加樣回收率

稱取訶子藥材粉末（西藏，50目）約50 mg，6份，精密稱定，分別加入沒食子酸對照品溶液5ml（3.63mg·mL-1），加入45 mL 60%乙醇，稱重，50℃溫浸12小時，冷卻后再次稱重，補(bǔ)足減失重量，濾過，棄去初濾液。按“2.1.9”測定吸光度，計算總鞣質(zhì)含量，結(jié)果（表1）。

2.1.9 總鞣質(zhì)含量測定

按“2.1.1”方法制備不同批次訶子供試品溶液，每個批次制備3份，各取2 mL，移入25 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻。按“2.1.1項”顯色，測定吸光度，計算總酚量。精密吸取25 mL供試品溶液加至盛有干酪素1.2 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照”2.1.1項”下的顯色測定吸光度，計算不被吸附的多酚量，并計算總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果（表2）。

表1 訶子鞣質(zhì)加樣回收率結(jié)果

表2 不同產(chǎn)地訶子藥材中總鞣質(zhì)含量

2.2 HPLC法同時測定訶子藥材中7種成分含量

2.2.1 溶液的制備

對照品溶液制備：對照品溶液A：精密稱取對照品沒食子酸、沒食子酸甲酯、安石榴苷（A 35.221%，B 63.619%）、柯里拉京、鞣花酸適量，加少量DMSO溶解，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為沒食子酸沒食子酸4.6500 mg·mL-1，沒食子酸甲酯0.4800 mg·mL-1、安石榴苷 4.1200 mg·mL-1，柯里拉京 1.7300 mg·mL-1、鞣花酸4.1800 mg·mL-1。對照品溶液B：精密稱取五沒食子酰葡萄糖適量，加50%甲醇制成濃度為1.2000 mg·mL-1。避光低溫保存。

供試品溶液配制：稱取訶子藥材粉末0.2 g（過60目篩）精密稱定，置100 mL錐形瓶，精密加入60%甲醇50 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻至室溫，稱重，補(bǔ)足減失重量。濾過，棄去初濾液，即得供試品溶液。進(jìn)樣前，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.2.2 訶子藥材中7種成分的含量測定

2.2.2.1 色譜條件

安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）；流動相為磷酸水（0.1%）（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0-10 min，3%-6%B；10-25 min，6%-15%B；25-45 min，15%-20%B；45-50 min，20%-22%B；50-60 min，22%-30%B；60-70 min，30%-35%B；70-85 min，35%-37%B；85-90 min，37%-43%B；90-100 min，43%-45%B；100-105 min，45%-90%B。流速 1 mL·min-1，柱溫35℃，根據(jù)各化合物吸收波長，選擇檢測波長270 nm，進(jìn)樣量20 μL。色譜圖（圖1）。

圖1 訶子藥材和混合對照品HPLC圖譜（270 nm）

表3 7種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.2.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液A（沒食子酸、沒食子酸甲酯、安石榴苷、柯里拉京、鞣花酸）10、20、40、80、160、200 μL，對照品溶液B（五沒食子酰葡萄糖儲備液）10、20、40、80、200、400 μL于2 mL容量瓶，加50%的甲醇稀釋至刻度，按“2.2.2.1”色譜條件，各進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和線性范圍。結(jié)果表明，7種化合物在各自質(zhì)量范圍內(nèi)線性良好。（表3）。

2.2.2.3 精密度試驗

按照“2.2.1”項下制備訶子（西藏）供試品溶液，按照“2.2.2.1”項條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、沒食子酸甲酯、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、五沒食子酰葡萄糖、鞣花酸峰面積積分值的RSD分別為1.70%、1.75%、1.15%、1.54%、2.30%、0.80%、0.28%，說明儀器具有良好的精密度。

2.2.2.4 穩(wěn)定性試驗

按照“2.2.1”項下制備方法制備訶子（西藏）供試品溶液，分別在避光條件下放置0、2、4、6、8、10、12、24h，按照“2.2.2.1”項條件進(jìn)樣20 μL，測定色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、沒食子酸甲酯、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、五沒食子酰葡萄糖、鞣花酸的RSD分別為1.83%、1.38%、2.44%、1.41%、2.25%、0.77%、0.43%，表明這7種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.5 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批次訶子（西藏）藥材粉末6份，按“2.2.1”項下制備供試品溶液的方法平行操作，按照“2.2.2.1”項條件進(jìn)樣20 μL，測定色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、沒食子酸甲酯、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、五沒食子酰葡萄糖、鞣花酸的RSD分別為1.74%、2.56%、2.22%、2.88%、2.90%、1.17%和2.70%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.2.6 藥材加樣回收率試驗

稱取已知含量的訶子（西藏）藥材粉末6份，每份約100 mg，精密稱定，分別加入2.300 mg·mL-1的沒食子酸，1.039 mg·mL-1的安石榴苷，1.482 mg·mL-1的鞣花酸，0.400 mg·mL-1的沒食子酸甲酯，0.596 mg·mL-1的柯里拉京，0.420 mg·mL的五沒食子酰葡萄糖對照品溶液各1.0 mL，精密加入60%甲醇45 mL，稱重，超聲提取 1 h，冷卻至室溫，補(bǔ)足重量。過濾，棄去初濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。按照“2.2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定7個指標(biāo)性成分的峰面積。計算回收率和RSD值，結(jié)果見表4，藥材中沒食子酸、安石榴苷A、沒食子酸甲酯、安石榴苷B、柯里拉京、五沒食子酰葡萄糖和鞣花酸平均回收率依次分別為102.77%、100.10%、100.40%、100.53%、100.27%、100.23%、100.37%，RSD依次分別為0.99%、2.26%、1.62%、2.19%、1.08%、1.85%、1.40%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.2.7 訶子藥材中7種成分的含量測定

取12批訶子藥材樣品，每份約0.2 g，按“2.2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算藥材中各成分的含量（表5）。

3 討論

3.1總鞣質(zhì)含量測定結(jié)果顯示7批訶子藥材中，西藏產(chǎn)訶子鞣質(zhì)含量較高為36.24%，湖南產(chǎn)訶子總鞣質(zhì)含量最低為17.60%，廣西5個批次藥材總鞣質(zhì)含量在21.43-36.18%之間。

3.2 HPLC法同時測定訶子藥材中7種成分含量時比較了40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇為提取溶劑，結(jié)果顯示，以60%甲醇為提取溶劑時，所得指標(biāo)性成分峰面積較大，提取率高。比較了60%甲醇超聲提取20 min、40 min、1 h的效果，結(jié)果顯示，提取1 h的提取率最高，故本實驗采用60%甲醇超聲提取1 h，作為供試品溶液制備方法。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

3.3 單體成分含量測定表明，湖南產(chǎn)訶子7個成分含量總和顯著低于西藏和廣西，本研究可為訶子藥材及其制劑的進(jìn)一步研究提供參考。

表5 12批次訶子藥材中7種成分測定結(jié)果（n=3）