基于生物信息學分析的卵巢癌微小RNA調控網絡的初步構建

李丹丹，丁世家，陳維賢△

(1.重慶醫科大學第二附屬醫院檢驗科，重慶 400010;2.重慶醫科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

卵巢癌是婦科最常見腫瘤之一，病死率極高、預后差，是女性健康的嚴重威脅之一[1]。由于卵巢癌沒有特殊的預防措施，同時多數患者早期表現隱匿，不易引起重視，診斷明確往往已屬晚期，失去治療及手術最佳時期，臨床提倡早發現、早治療，因此，疾病發病機制的研究對早期診斷及防控具有重要的臨床意義[2]。大量研究顯示，卵巢癌的發生、發展受到多種基因的調控，微小RNA(miRNA)及長鏈非編碼RNA(lncRNA)是兩類重要的RNA，參與細胞生長的一系列重要進程，包括細胞增殖、分化、凋亡及死亡等過程，其在基因轉錄及翻譯過程中調控具有極為重要的作用，在卵巢癌發生發展過程中，miRNA表達失調將導致細胞的過度增殖、過度分化，從而導致腫瘤的發生發展。由于miRNA介導的基因調控在卵巢癌中發病機制復雜，目前尚未完全闡明。鑒于將循證生物學信息分析和實驗論證相結合，有利于從循證研究角度為miRNA、lncRNA及靶基因關聯的進一步研究提供研究證據。本研究采用現代分析軟件，在生物信息學分析基礎上初步構建卵巢癌miRNA及匹配lncRNA調控網絡，探討miRNA在卵巢癌細胞中的分子調控機制，為卵巢癌的早期診斷、早期治療提供有力的參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1資料來源 基因分析中常用的miRNA及lncRNA分析數據庫：miRwalk 2.0數據庫(網址：http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html)[3]；HMDD v2.0數據庫(網址：http://www.cuilab.cn/hmdd)[4]；starBase v2.0(網址：http://starbase.sysu.edu.cn/)[5]；lncRNA 疾病數據庫(網址：http://www.cuilab.cn/lncrnadisease)[6]。

1.2研究方法 以“ovarian cancer”為關鍵詞，通過miRwalk 2.0軟件及HMDD v2.0查詢已證實與卵巢癌相關的miRNA，根據相應miRNA在miRwalk 2.0軟件文獻鏈接出現頻次進行篩選，明確出現研究頻次大于7的相對高頻miRNA 7個，通過miRwalk 2.0明確其對應靶基因表達情況。在lncRNA疾病數據庫查詢與卵巢癌相關的lncRNA，并運用 starBase v2.0 對所得到的miRNA和lncRNA進行綜合分析，得到與上述miRNA相互作用的且與卵巢癌相關的lncRNA，最終繪制miRNA在卵巢癌中的分子調控網絡。

1.3分析方法 將卵巢癌相關miRNA、lncRNA及靶基因均錄入Excel 2007，并進行統計描述分析，miRNA在卵巢癌中的分子調控網絡采用Cytoscape軟件制圖[7]。

2 結 果

2.1卵巢癌相關miRNA及靶基因 通過對miRwalk 2.0數據庫及HMDD v2.0數據庫同時查詢并進行整理后，初步發現卵巢癌相關的 miRNA共172個，其中有8篇以上文獻報道的miRNA有hsa-let-7a、hsa-mir-21、hsa-miR-16、hsa-mir-17、hsa-mir-19b、hsa-mir-29a、hsa-mir-92a。運用 miRwalk 2.0 分析上述7個miRNA的靶基因，基因查找及靶基因篩選結果見表1。

表1 HMDD v2.0及miRwalk 2.0數據庫中與卵巢癌相關的miRNA

2.2與卵巢癌密切相關的miRNA的lncRNA 通過lncRNA數據庫查閱卵巢癌相關lncRNA條目，共查詢到38條結果，將lncRNA通過miRwalk 2.0軟件，通過 lncRNA Gene Symbol及miRNA進行關聯，明確lncRNA Gene與7個高頻基因，見表2。

表2 miRwalk 2.0數據庫卵巢癌相關的miRNA對應lncRNA

2.3經Cytoscape軟件繪制miRNA在卵巢癌中的分子調控網絡 通過對卵巢癌相關高頻miRNA及卵巢癌相關性文獻檢索發現相應基因在卵巢癌調控中具有重要作用，如hsa-let-7a高表達對卵巢癌具有一定保護作用，高表達患者具有相對更低的死亡風險[8]。hsa-mir-21在卵巢癌患者中具有高表達的趨勢[9]，hsa-miR-16通過介導多種基因的表達從而對卵巢癌治療預后產生影響，has-mir-17通過對ITGA5和ITGB1等靶基因作用于卵巢癌細胞的轉移產生作用。各目標miRNA與miRwalk 2.0數據庫中查閱到高頻作用基因的調控網絡見圖1。通過lncRNA疾病數據庫查詢與卵巢癌相關lncRNA有17個，運用starBase v2.0對所得到的miRNA和lncRNA進行綜合分析發現，lncRNA X(染色體)失活特異性轉錄物(XIST)、H19、HOXA11-AS、PVT1、TUG、GAS5、HOTAIR、MALAT1的表達均有一定作用，其中以XIST在卵巢癌發生、發展過程中起到較為中心的作用，上述所有miRNA均對XIST的表達及調控具有一定作用，具體調控網絡見圖2。

圖1 miRNA及相關基因在卵巢癌中的分子調控網絡

圖2 miRNA及相關lncRNA在卵巢癌中的

3 討 論

研究分析miRNA與疾病的關系對疾病的診斷及治療具有重要意義[10-11]。研究顯示，人類約1/3的基因轉錄及翻譯受miRNA調控。作為長度僅為20～24個核苷酸的小分子RNA，miRNA不僅維持正常細胞的結構、功能，而且其表達異常對腫瘤的發生、發展亦具有重要作用。因此，通過miRNA介導的基因表達調控是腫瘤防治的重要方向。本研究通過對miRwalk 2.0等miRNA及基因數據庫的數據挖掘，利用其大數據分析功能對卵巢癌相關miRNA及數據庫中靶基因進行整合及聚類分析，從而實現卵巢癌miRNA調控網絡的初步構建。復雜的調節網絡中，單個miRNA可同時對多個靶基因進行調控，同一基因也可能受到多個miRNA的調控，本研究發現hsa-let-7a、hsa-mir-21、hsa-miR-16、hsa-mir-17、hsa-mir-19b、hsa-mir-29a、hsa-mir-92a等7個基因均參與了多種基因表達的調控，如圖1所示，hsa-let-7a同時參與了WEE1、KLHL15、MBNL1、ZNF460、AGO1、MYC、DICER1、TNFRSF10B、CCND2、CCND1、BCL2等多基因調控。而基因WEE1則同時受到hsa-mir-21、hsa-miR-16、hsa-mir-17、hsa-mir-19、hsa-mir-29a、hsa-mir-92a等多種miRNA調控，如此多種miRNA與基因的調控構成一個調控網絡，對卵巢癌的生長及分化等多過程進行調節。

lncRNA是一類200 nt的RNA，大量研究顯示其在癌基因表達調控中具有轉錄激活、修飾、調節等多種生物學功能。本研究通過數據庫檢索卵巢癌相關lncRNA條目，共查詢到38條結果，將lncRNA通過miRwalk 2.0軟件，通過lncRNA Gene Symbol 對miRNA進行關聯，明確了lncRNA基因與7個高頻基因，這與已報道的卵巢癌相關lncRNA基因具有一致性[12]。如圖2所示，lncRNA XIST作為核心調控因子與高頻miRNA相互作用介導卵巢癌基因調控，lncRNA H19也具有重要作用，這與國外相應研究結論基本一致[3]。lncRNA也可以作為一種競爭性內源性RNA(ceRNA)與miRNA相互作用，lncRNA與miRNA之間具有相互調控關系，并通過調控靶基因的表達，在卵巢癌發生、發展中發揮重要作用。

4 結 論

卵巢癌侵襲轉移是多因素作用的結果，miRNA及lncRNA均在上皮性卵巢癌中的侵襲、轉移方面有著重要意義。miRwalk、HMDD、starBase等是常用的生物信息學分析數據庫，可有效地用于miRNA與疾病關系研究[13]。本研究利用生物信息學分析技術成功描繪了一張與卵巢癌相關的miRNA分子調控網絡，為卵巢癌相關分子機制研究、早期診斷、早期治療提供了有力的技術支撐。