環狀RNA研究進展

孫 暢 綜述,張朝霞 審校

(新疆醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗中心，新疆烏魯木齊 830054)

人類基因組中絕大多數的序列不編碼蛋白質，非編碼RNA(ncRNA)占全部從真核基因組轉錄的RNA的95%[1]。大部分ncRNA為轉錄超保守區域，包括微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、PIWI相互作用RNA(piRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環狀RNA(circRNA)，在基因調控和許多人類疾病的發展中起著越來越重要的作用[2]。作為ncRNA中的主要一員，circRNA在過去幾年里引起了廣泛的關注。

1 circRNA簡介

circRNA是封閉的環狀分子，不具有5′至3′極性的共價閉環結構或3′ poly A末端[3]。1976年，電子顯微鏡技術首次發現了circRNA。根據結構特點、未知功能和低豐度[4]，circRNA最初被認為是保守的分子產生的錯誤的拼接副產品，并沒有得到太多的關注。然而，隨著生物技術的進步，特別是生物信息學和高通量測序技術的發展已經鑒定了大量的circRNA。事實上，circRNA是豐富、多樣和保守的分子，通常在組織表達和發育階段具有特定的方式[5-7]。具體而言，circRNA可以起到miRNA海綿的作用，阻止mRNA翻譯并通過調節剪接或轉錄和與RNA結合蛋白(RBP)的相互作用影響基因表達[8-12]。

2 circRNA對基因的調控作用

已經提出circRNA通過幾種機制發揮作用，包括miRNA海綿、轉錄的修飾以及拼接修飾。

2.1circRNA作為miRNA海綿 大多數circRNA主要定位于細胞質中[5，13]，這一結果促使研究人員研究了circRNA在轉錄后調控中的功能，2個研究小組首次證明了circRNA可能作為miRNA海綿或競爭性內源RNA(ceRNA)來調控miRNA靶標的表達。 miRNA可以通過種子區域與mRNA的3′非翻譯區域結合，并且circRNA也包含miRNA靶位點。通過與miRNA競爭，circRNA間接調節mRNA的翻譯。這些研究還發現，ciRS-7 circRNA含有60多個保守的miR-7靶位點，可以作為miR-7的海綿，從而調節miR-7靶mRNA的表達。此后不久，2項研究指出大多數circRNA含有比共線性mRNA更少的miRNA結合位點[14-15]，因此，不能起到miRNA海綿的作用。然而，越來越多的研究發現，盡管缺乏大量的miRNA結合位點，許多circRNA仍可以發揮這種功能。因為越來越多的證據表明這種功能在不同物種中是保守的，所以circRNA作為miRNA海綿的作用并不是一個孤立的現象。已經證明小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(CDR1as)含有多達74個miR-7的結合位點，同時可以結合RNA誘導的沉默復合物(RISC)的Argonaute(AGO)蛋白[16]。然而，含有多個miRNA結合位點的circRNA可能不具有普遍性，因為迄今為止鑒定的大多數circRNA不包含富集特定miRNA的結合位點[14]。circRNA作為miRNA海綿的證據也可以從CDR1as基因敲除小鼠的數據中看到。基因敲除動物中miR-7和miR-671的水平均較低，這些變化也與突觸傳遞的缺陷相關[17]。這可能是由于一個具有多個結合位點的circRNA將影響大量miRNA靶標的表達。單個miRNA結合位點是否能夠有效提高cicRNA與miRNA相互作用仍有待探索。此外，它們對于miRNA的儲存、分類和定位也很重要，從而促進了miRNA對靶基因的調控作用[18-19]。

2.2轉錄調控和選擇性剪接 circRNA主要分為三類：外顯子環狀RNA(ecircRNA)[5,16,20]環狀內含子RNA(ciRNA)[20]和外顯子-內含子環狀RNA(EIciRNA)[11]。幾乎所有分布在細胞質中的circRNA都來自于外顯子[5,13];相反，circRNA和EIciRNA主要位于細胞核內[8，20]，并且很可能在轉錄水平中起作用。已證實EIciRNA與U1小分子相互作用，核糖核蛋白(U1snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ(PoⅡ)通過U1snRNA結合位點結合并執行類似的順式調節功能[11]。此外，circRNA調節其親本基因順式或反式轉錄并與其PolⅡ復合體相互作用在細胞核中激活其親本的轉錄基因[20]。circRNA生物發生的反向剪接模式可以改變線性基因產物的表達。 在拼接過程中，拼接和線性拼接可以相互競爭，結果產生線性RNA或ecircRNA[10]。例如，在circMb1形成期間，circMb1與MBL前體mRNA剪接競爭，并因此負向影響規范剪接[10]。此外，在ecircRNA形成的過程中一些ecircRNA會將翻譯起始位點隔開，從而導致非編碼線性轉錄物的產生并由此減少蛋白質表達[15]。

3 circRNA與人類疾病

基于circRNA的功能，研究人員調查了circRNA在生理和病理學中的作用。現有的證據顯示circRNA與自噬[21-22]、細胞凋亡[23]、細胞周期[12]和增殖相關，表明circRNA可能在疾病中起作用，并且越來越多的研究表明，circRNA通過不同的途徑在不同疾病中發揮調節功能。而且，circRNA有潛力作為臨床診斷指標與治療靶點。

3.1神經系統疾病 一項研究發現，circRNA在哺乳動物腦中被檢測到的豐度比在其他組織中更高[6，24]，促使許多研究人員探討circRNA在神經系統疾病中的作用。觀察到circRNA ciRS-7和miR-7的共定位，特別是在新皮質和海馬神經元中大量存在[8]。 因此，ciRS-7可以執行其“海綿”功能，調節涉及帕金森病的miR-7并參與各種癌癥途徑。 研究人員認為，ciRS-7是神經元功能的關鍵因子，在神經系統疾病和腦腫瘤發展中具有重要作用[8]。

3.1.1circRNA和阿爾茨海默病(AD) AD的研究揭示了ciRS-7水平在AD患者海馬CA1樣品中的表達較年齡相匹配的健康對照中顯著降低。 因此，預測ciRS-7缺陷可能導致選擇性miR-7靶標的表達降低。 這個猜想已在隨后的研究被證實[25],ciRS-7也抑制核因子-κB(NF-κB)的翻譯并誘導其定位于細胞質，從而抑制UCHL1的表達，促進淀粉樣前體蛋白(APP)和β-分泌酶(BACE1)降解[26]。值得注意的是，APP和BACE1在AD中產生淀粉樣β蛋白而起作用[27-28]。由此推斷，ciRS-7可作為治療AD的有效靶點。

3.1.2circRNA和其他神經系統疾病 最近報道RNA結合蛋白(FUS)影響小鼠胚胎干細胞運動神經元中的circRNA表達[29]。考慮到FUS的神經退行性，包括肌萎縮側索硬化和額顳葉癡呆[30]，先前的研究不僅闡明了FUS連接的circRNA表達的機制，而且還將circRNA功能與神經退行性過程聯系起來。ZHOU等[31]通過測序分析調查神經損傷誘導的神經病理性疼痛(NP)，分析大鼠脊髓內ncRNA的差異表達，結果顯示188個circRNA在無痛神經損傷后14 d內顯著失調,研究人員構建了一個circRNA-miRNA-mRNA網絡并驗證了rno-circ-0006928和miR-184之間的關系,通過熒光素酶檢測，研究結果提示circRNA在NP的發病機制中起關鍵作用。另一組對來自多系統萎縮(MSA)的患者的腦組織樣品進行測序發現5種過表達的circRNA：IQCK、MAP4K3、EFCA11、DTNA和MCTP1。進一步的分析顯示這些circRNA在MSA皮質白質組織中過表達[32]。此外，BAI等[33]發現circDLGAP4在急性缺血性卒中患者的血漿和小鼠卒中模型中下調，circDLGAP4的過表達通過對miR-143的“海綿”作用促進HECTD1表達，改善小鼠卒中模型中梗死面積和血腦屏障損傷。調查顯示circDLGAP4可能成為急性缺血性損傷的一種新的治療靶點。另一項研究表明，hsa-circRNA-103636在外周血單個核細胞中的表達可能作為重度抑郁癥患者一個新的診斷和治療生物標志物[34]。

3.2心血管疾病 幾項研究表明，circRNA在心血管疾病的發生和發展中發揮重要作用。例如，WU等[35]發現在高血壓患者中hsa-circ-0005870顯著下調。而且，hsa-circ-0002062和hsa-circ-0022342在慢性血栓栓塞性肺動脈高血壓患者血樣中下調[36]。此外，一個研究小組表示，與健康對照組相比，心肌梗死患者外周血標本中circRNA MICRA的表達水平較低。低水平的MICRA患者左心室功能障礙的風險較高[37]。

3.3骨性關節炎(OA) OA是由于關節軟骨的退行性變化引起的。與非OA對照組相比，在OA患者的軟骨中有71個circRNA差異表達。 隨著促炎癥信號分子如白細胞介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達增加，circRNA-CER表達增加。circRNA-CER的抑制導致基質金屬蛋白酶13(MMP13)表達降低和細胞外基質(ECM)重塑。 研究者認為，這一觀察結果源自circRNA-CER對miR-136的海綿效應，且已知其靶向MMP13基因[38]。

3.4癌癥

3.4.1circRNA和胃癌 circRNA是胃癌發生和發展的重要調節因子。 circRNA-100269在胃癌中下調并可抑制胃癌細胞通過靶向miR-630的新途徑生長[39]。 circ-LARP4通過刺激miR-424-5p可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲并調節LATS1表達[39]。還有報道稱circPVT1、circ-0047905、circ-0138960和circ-RNA7690-15可能在胃癌腫瘤發生中起癌基因的作用[40-41]。因此，這些結果表明circRNA可能具有潛力作為胃癌診斷和預后的生物標志物。

3.4.2circRNA和人肝細胞癌(HCC) 研究表明，ZKSCAN1 mRNA和circ-ZKSCAN1密切合作抑制人類HCC細胞的生長、遷移和入侵，circ-ZKSCAN1過表達可能預示HCC的良好預后[42]。 XU等[43]報道，HCC患者CDR1as過表達，而miR-7表達水平降低，表明二者之間成負相關。CDR1as在HCC細胞中是一種致癌物質，通過吸附miR-7來促進HCC細胞的增殖和轉移。

3.4.3circRNA和肺癌 ZHU等[44]研究了circ-0013958在非小細胞肺癌(NSCLC)中的功能，發現它可以吸引miR-134，并上調致癌細胞周期蛋白D1，在NSCLC的發展中具有重要作用，研究者認為circ-0013958可以用作早期的非侵入性生物標志物檢測以篩查肺癌。YAO等[45]的研究表明，circ-100876在NSCLC組織中明顯高于相鄰非腫瘤組織，其表達水平與NSCLC的淋巴結轉移和腫瘤分期相關，提示circRNA與肺癌腫瘤的發生和進展密切相關。

3.5circRNA和感染 微生物脂多糖誘導Toll受體(TLR)途徑的激活，導致NF-κB的激活，參與微生物感染的防御和宿主的適應性免疫關鍵基因的調節。已經提出circRasGEF1B作為脂多糖反應的一部分調節ICAM-1的表達。在體外敲除該circRNA導致27%～39%的ICAM-1抑制減少；在小鼠巨噬細胞中，激活TLR4、TLR9、TLR3、TLR2和TLR1受體均調控circRasGEF1B的表達；在正常情況下通過基因修飾circRasGEF1B可以降低ICAM1的表達水平，這會促進白細胞與內皮細胞的結合及其向目標組織的遷移[46]。因此，circRasGEF1B的缺乏可能會阻止白細胞遷移到炎癥部位，并干擾愈合過程，而在癌細胞中，可能還會影響細胞毒性T淋巴細胞的激活，而這些細胞毒性T淋巴細胞則將細胞溶解顆粒釋放到腫瘤細胞中[46]。

已有研究報道了circRNA在病毒感染反應中的潛在作用。通過circRNA轉染HeLa細胞，證實84種先天免疫相關基因的誘導表達，如RIGI和OAS1，分別上調了500倍和200倍[47]。 circRNA也可以作為與病毒線粒體RNA(mtRNA)競爭結合的競爭者。這些因素可以通過穩定核內的內含子RNA對的結合來促進環化。病毒感染導致運輸這些因子從細胞核到細胞質的circRNA在細胞中的表達下降。這種作用使得circRNA可用于與病毒mRNA結合并防止病毒感染宿主細胞[48]。

ZHANG等[49]探索了肺結核(PTB)的表達譜，對3名PTB患者和3名健康個體中的circRNA使用全轉錄組測序。其中患者和健康人共鑒定出170個差異表達的circRNA;其中102個上調，68個下調。在表達模式中，26個circRNA上調(> 5倍變化)，這表明這些差異表達的circRNA在PTB的發病機制和進展中發揮作用，尤其是hsa-circRNA-14623、hsa-circ-09585、hsa-circ-005538、hsa-circ-09993、hsa-circ-00074和hsa-circ-13478被證實在PTB中顯著失調。這些失調的circRNA可能作為新的生物標志物用于診斷PTB，這需要在大型患者隊列中進一步研究。

4 circRNA的檢測方法

由于生物信息學和高通量測序技術的快速發展，許多方法被用于檢測circRNA。它們對于檢測新的環狀RNA具有不同的優勢。現將circRNA的3種主要檢測方法介紹如下。

4.1基因芯片技術 基因芯片技術是將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息。可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足[50]。基礎芯片技術具有高靈敏度和高通量的特點，檢測快速、高效，此外，該方法目前已較為成熟且應用較廣[51]。

4.2RNA測序技術(RNA-seq) RNA-seq利用不同種類的RNA逆轉錄成cDNA，通過對cDNA建庫、測序，從而可以獲得相應RNA的序列、結構及其表達量，可以準確地測定出circRNA 的表達水平。其采用數字化信號直接測定特定序列，具有起始RNA用量少、通量高、背景低且靈敏度高的優點。此外，RNA測序技術還可以發現新的基因，是目前深入研究基因組學的有力工具[52-53]。

4.3定量逆轉錄PCR法(RT-qPCR) RT-qPCR是目前常用的檢測方法之一，其通過將circRNA逆轉錄成cDNA,然后以cDNA為模板進行擴增，實時檢測擴增產物的數量，間接實現circRNA的定量分析。RT-qPCR具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本低等突出優點，常被用來作為基因芯片法等方法進一步的驗證和確認[54]。

5 展 望

circRNA是一類ncRNA，可以通過各種機制調控基因表達，也可能有編碼蛋白質的潛力，這種機制尚未被完全理解。盡管如此，circRNA正在成為潛在的重要細胞生理學的調節者以及作為疾病發生或進展的潛在生物標志物。目前關于circRNA生物學的知識尚處于早期階段，迫切需要進一步的研究，徹底了解其功能和潛力。此外，雖然很多研究已經證明了circRNA在疾病治療中的潛在作用，circRNA是否可以作為靶點治療疾病仍有待確定。