5種免疫透射比濁法試劑盒檢測特定蛋白鉤狀效應的性能評估

楊 杰，李 玲，張瀚允，張 鵬，曾方銀△

(1.南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣東廣州 510515；2.南方醫科大學第五附屬醫院檢驗科，廣東廣州 510900)

免疫比濁測定是臨床常用的檢測技術，根據其方法原理的不同，可分為免疫散射比濁法和免疫透射比濁法；前者需要專用的散射免疫分析儀，而后者可在全自動生化分析儀上自動進行。采用全自動生化分析儀進行免疫透射比濁測定，具有分析速度快、檢測成本低、自動化程度高的特點。近年來，隨著膠乳增強技術的改進、試劑盒質量的提高、量值溯源的進步，臨床上采用免疫透射比濁法測定血液、體液中的微量物質越來越普遍[1-5]。但早在1935年HEIDELBERGER對沉淀素的研究時就發現抗原濃度與免疫復合物沉淀量之間呈非線性的關系：在恒定劑量的抗體溶液中加入不同劑量的抗原時，免疫復合物的生成量，起初隨著抗原劑量的增加而逐步增加；當達到峰值后，生成量隨著抗原劑量的進一步增加反而減少。1974年MILES等[6]根據劑量-效應測試曲線的形狀，首次提出hook效應(即鉤狀效應)這一概念。目前鉤狀效應多指抗原過剩，準確來說應稱為高劑量的鉤狀效應。如果標本中待測物濃度過高，免疫透射比濁法的結果會受到鉤狀效應的影響而出現假性低值；若檢測者不能及時發現這一問題，則會發出錯誤報告，嚴重影響患者診斷和治療[7-8]。不同品牌的試劑，防范鉤狀效應的能力不盡相同，筆者選擇了市場占有率比較高的5種試劑盒，以臨床上易出現高值的6個特定蛋白項目為例，進行抗原過量性能對比實驗，評估不同試劑盒應對鉤狀效應的性能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 準備各項目的高濃度樣本，鏈球菌溶血素O(ASO)和尿微量清蛋白(mALB)高濃度樣本來源于人高值血清混合物；超敏C反應蛋白(hs-CRP)、β2-微球蛋白(β2-MG)、視黃醇結合蛋白(RBP)高值標本由人體液提取純化的各自蛋白純品組成；血清胱抑素C(CysC)高值標本是重組人胱抑素C蛋白。以上6個項目的實驗樣本最高濃度至少不低于前期收集的臨床樣本最高可見濃度(數據未展示)。

1.2儀器與試劑 深圳邁瑞SAL 8000生化免疫一體機。北京九強生物技術股份有限公司、四川邁克生物科技股份有限公司、深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司、寧波美康生物科技股份有限公司和北京利德曼生化股份有限公司(依次以A、B、C、D、E表示)各自生產的ASO、hs-CRP、β2-MG、CysC、RBP、mALB免疫透射比濁法試劑盒，并提供對應配套的校準品和質控品(四川邁克生物科技股份有限公司目前無RBP試劑盒)。

1.3方法

1.3.1不同濃度梯度的樣品制備 將上述各項目的高值樣本用生理鹽水進行不同比例的稀釋(mALB高值樣本用尿液稀釋)，每個項目形成不同數量濃度梯度的樣品，如ASO和β2-MG各有30和27個濃度梯度，理論樣品濃度范圍分別為50～10 000 IU/mL 和1.1～226.3 mg/L。

1.3.2樣品測試 在SAL 8000生化免疫一體機的BS-2000生化模塊上按各廠家試劑盒說明書設定各項目的檢測參數，再用各自配套的校準品對儀器進行校準，對高低2個濃度水平的質控品進行室內質控，確保室內質控在控的情況下測試每個項目不同濃度梯度的樣品，每個樣品重復檢測2次。

1.4數據處理 以每個樣品2次檢測結果均值為縱坐標，理論濃度為橫坐標，繪制劑量-效應曲線，確定其后帶限(劑量-效應曲線右側與分析測量范圍上限吸光度信號相等的濃度點)，即抗原過量時檢測的安全范圍(分析測量范圍上限至后帶限之間的濃度范圍)上限。

2 結 果

2.15種試劑盒不同項目的劑量-效應曲線 樣品實測濃度起初隨著配制濃度的升高而升高，在到達平衡點濃度之后實測值隨樣品濃度升高反而減少(圖1～6)。如圖1中A、B、C、D、E 5種試劑測定ASO時，其抗原-抗體結合達到平衡點時的ASO濃度分別為1 150、4 000、5 000、3 000、2 000 IU/mL左右，超過以上濃度后劑量-效應曲線呈下降趨勢。

2.25種試劑盒抗原過量安全范圍上限 劑量-效應曲線的濃度變化和生產廠家宣稱的分析測量范圍上限進行比較，估計出抗原過量安全范圍上限，見表1。其中B、C、D 3種試劑盒測定ASO的安全范圍上限最大，可達到10 000 IU/mL 以上，A和E則分別在理論濃度為1 150 IU/mL 和4 000 IU/mL左右會發生鉤狀效應；B、C試劑測定hs-CRP的安全范圍上限超過1 000 mg/L，A、E分別為750 mg/L 和340 mg/L 左右，而D試劑盒宣稱的hs-CRP分析測量范圍上限為15 mg/L，測試無意義；B、C試劑盒測定β2-MG時，在226 mg/L 左右仍未出現鉤狀效應，A和E的安全范圍上限分別為204 mg/L 和147 mg/L 左右，D顯示的安全范圍上限最小，僅為18 mg/L 左右；CysC檢測結果表明，C和E試劑的安全范圍上限最大，可達到112 mg/L 以上，其次是A和B，均在11 mg/L 左右出現鉤狀效應，最小的是D，僅在9 mg/L 左右即出現鉤狀效應；A、C、E 3種試劑盒檢測RBP時的安全范圍上限均在700 mg/L 以上，D在550 mg/L 左右；對于mALB的測定，A和B安全范圍上限較低，分別在6 534 mg/L 和2 178 mg/L 左右，C試劑盒在理論濃度21 780 mg/L 左右會出現鉤狀效應，而D試劑安全范圍上限可高達43 560 mg/L 以上(配制的mALB樣品從第3個濃度開始反應度超過D試劑盒最高濃度校準品反應度，結果用反應度和校準規則計算)，E試劑盒在檢測高濃度mALB樣本時出現干擾，結果不準確，不予分析。

圖1 ASO劑量-效應曲線

圖2 hs-CRP劑量-效應曲線

圖3 β2-MG劑量-效應曲線

圖4 CysC劑量-效應曲線

圖5 RBP劑量-效應曲線

圖6 mALB劑量-效應曲線

項目AmhookBmhookCmhookDmhookEmhookASO(IU/mL)1 2001 1501 000>10 0001 000>10 000800>10 0004004 000hs-CRP(mg/L)320750320>1 000320>1 00015-160340β2-MG(mg/L)5020480>22618>226181820147CysC(mg/L)8117.8118>112898>112RBP(mg/L)250>700--150>700126550100>700mALB(mg/L)2006 5344002 17830021 780300>43 5601 000-

注：m表示試劑宣稱的分析測量范圍上限；hook表示抗原過量安全范圍上限；-表示無數據

3 討 論

臨床上經常測定的多種血漿蛋白類物質如CysC、mALB、ASO、RBP、hs-CRP等病理濃度分布范圍寬廣，在疾病重癥狀態下其濃度顯著升高，可達到異常高值甚至超過正常參考區間上限的百倍以上。其臨床可見的濃度越高，超過檢測系統分析測量范圍上限而出現鉤狀效應的風險越大。因此，及時發現檢測過程中出現的鉤狀效應，防止報告偏低甚至錯誤的測定結果仍是臨床需要高度重視的問題。

本研究以5種免疫透射比濁法試劑盒檢測6種特定蛋白項目為例，進行了鉤狀效應的對比實驗，結果發現不同廠家試劑能達到的抗原過量安全范圍有很大差異，如B、C、D,3種試劑盒測定ASO時，抗原過量安全范圍上限均大于10 000 IU/mL，而A僅為1 150 IU/mL左右，B試劑盒測定β2-MG的安全范圍上限在226 mg/L 以上，而D僅為18 mg/L 左右，結果較易受到鉤狀效應的影響。抗原過量的安全范圍主要與試劑的質量有關，試劑盒的配方至關重要，包括抗體質量(純度、效價)、抗體濃度、緩沖體系、聚乙二醇(PEG)的分子大小和濃度選擇、膠乳交聯技術等多個方面[9-10]。配方好的試劑盒若其分析測量范圍足夠寬，可以覆蓋所有臨床可見的樣本濃度，就不會存在鉤狀效應。研究表明，IgM試劑盒中抗體濃度越高，所能準確檢測到的抗原濃度越高，安全報告范圍也越寬，鉤狀效應出現得越少[11]。在其他條件已然優化的情況下，要拓寬分析測量范圍的關鍵是添加足夠多的抗體，但這勢必會大幅度提高試劑的成本，醫療機構和患者需要隨之付出更大的成本。因此，試劑盒的設計需要在成本和臨床性能之間達成一個平衡，才能以經濟有效的方法保證結果的準確性。

試劑盒的配方優化是防范鉤狀效應的一個有效手段，但并非萬能。要防止因鉤狀效應的出現而發出錯誤報告，還需要結合分析儀器的測量程序。不同品牌的全自動生化分析儀，其加樣、加試劑的步驟和時間、吸光度的測試時間點等差異較大，需要結合生化分析儀的具體性能，綜合應用多種方法，如反應曲線特征識別和報警、樣品預稀釋、抗原或抗體二次添加等[12-16]。而反應曲線特征識別和報警，不同廠家的報警參數算法也可能不同，對于采用開放系統的實驗室檢測人員，需要向廠家工程技術人員詳細了解其算法，根據預試驗的結果合理設置報警參數，并進行驗證，才能在出現鉤狀效應時及時給出有效提示。

一些廠家的免疫比濁試劑盒說明書上會宣稱抗原過量的安全范圍，如羅氏診斷和西門子醫療ASO試劑說明書宣稱其分別在4 000 IU/mL 和8 500 IU/mL 時未出現鉤狀效應，而很多廠家僅聲明了分析測量范圍的上限，未對鉤狀效應的限值作出說明。因此，實驗室在采購試劑的時候，應該關注廠家的性能宣稱，重視試劑的質量。臨床使用前，應該根據項目的病理生理濃度分布寬度進行鉤狀效應性能的驗證，驗證試劑盒抗原過剩區是否與蛋白的病理生理濃度兼容，選擇防范鉤狀效應性能最好的試劑盒，防止發出錯誤報告，減少標本的復測，降低檢測成本并提高工作效率。

4 結 論

本實驗發現不同廠家免疫透射比濁法試劑盒檢測特定蛋白時抗原過量安全范圍有較大的差異，實驗室在選擇試劑盒時對其防范鉤狀效應性能進行驗證很有必要；若結合測量程序的報警參數優化，可有效降低發出錯誤報告的風險。