孕晚期婦女無乳鏈球菌攜帶監測及其與陰道微環境關系研究

唐群力，肖林林，魏取好，肖 虎，趙衛衛，馮 景

(上海交通大學附屬第六人民醫院南院檢驗科，上海 201499)

無乳鏈球菌(或稱B族鏈球菌)是一種可以在胃腸道和泌尿生殖道中定植的條件致病菌，常定植于人類直腸和生殖道中，屬β溶血的革蘭陽性鏈球菌。無乳鏈球菌通常和懷孕期間與產后期間的醫療間期相關易感因素關系密切，當機體免疫力低下、廣泛使用抗菌藥物等時，容易引起機會性感染[1-2]。無乳鏈球菌與新生兒的致命疾病如敗血癥、肺炎和腦膜炎有關,被認為是新生兒疾病發展的最重要風險之一，無乳鏈球菌在孕婦中的定植率根據社會經濟、文化和人口狀況及用于檢測的方法而有所不同[3]。本研究采用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測孕晚期婦女無乳鏈球菌帶菌狀況,采用半定量法檢測其陰道分泌物乳酸桿菌水平，并結合數據分析相互之間的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2018年1月在本院婦產科門診和住院病房就診的孕晚期婦女(34～37周)共5 855例作為研究對象，并選取100例健康體檢女性為對照組，每位研究對象由婦產科醫生同時采集陰道分泌物(一支拭子樣本)及直腸分泌物(一支拭子樣本)送檢，無乳鏈球菌攜帶組、陰性組、對照組的乳酸桿菌檢測樣本使用白帶常規涂片后進行瑞姬染色。陰性質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，陽性質控菌株為無乳鏈球菌ATCC13813。采集過程嚴格按照樣本采集手冊執行，取樣對象知情同意。

1.2儀器與試劑 RT-qPCR儀購自瑞士羅氏診斷推出的Roche lightcycle 480Ⅱ，無乳鏈球菌核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)購自泰普生物科學(中國)有限公司，瑞氏-姬母薩染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。試劑盒采用PCR及熒光標記探針，檢測臨床樣本中無乳鏈球菌特定基因(CAMP)，從而判斷無乳鏈球菌的存在。據文獻報道，對于無乳鏈球菌的臨床樣本檢測中，RT-qPCR法與細菌培養法、測序法(金標準)的符合率達95%以上[4]。

1.3方法

1.3.1無乳鏈球菌檢測 在樣本拭子管內加入1 mL清洗液(10×濃縮清洗液與滅菌純化水按1∶9進行稀釋)，用震蕩混勻器高速震蕩2 min，將其制成樣本混懸液。吸取全部樣本混懸液至1.5 mL離心管內，13 000 r/min離心5 min后棄去上清，加入1 mL清洗液震蕩混勻重懸，13 000 r/min離心5 min后棄去上清(視樣本渾濁情況可重復本步驟)，加入50 μL清洗液重懸。然后向每只樣本管中加入1管等量提取固形物，用震蕩混勻器高速震蕩5 min，連同陰性對照、陽性對照質控樣本同樣提取流程提取基因組模板后，瞬時離心，每管分別加入10 μL內參照，95 ℃干浴2 min，冰浴5 min后13 000 r/min離心1 min，各取5 μL上清作為模板加入至配好的PCR擴增體系中進行擴增。擴增程序：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，共40個循環。擴增完畢，調整基線和閾值，確認陰陽性對照及質控在有效范圍內后判讀結果，陰性樣本FAM Cp值=40或“Undet”，陽性樣本FAM Cp值≤33且曲線呈明顯對數增長。

1.3.2陰道微環境指標檢測[5]將送檢的陰道分泌物制作出分泌物涂片，高倍鏡下觀察判讀清潔度并記錄結果，待干燥后用瑞氏-姬母薩染色液染色、晾干，于顯微鏡下油鏡下觀察乳酸桿菌水平及陰道菌落多樣性。依據2010年廖秦平[6]提出的陰道微生態評價標準，陰道乳酸桿菌菌群密集度及陰道菌群多樣性均可分為4個等級。其中，陰道乳酸桿菌菌群密集度的4級分級情況為：Ⅰ級(+)，油鏡下觀察每個視野平均細菌數量為1～9，換算成具體數值為105～106/mL；Ⅱ級(++)：油鏡下觀察每個視野平均細菌數量為10～99，換算成具體數值為107～108/mL；Ⅲ級(+++)：油鏡下觀察每個視野平均細菌數量超過100，換算成具體數值為109～1010/mL；Ⅳ級(++++)：油鏡下觀察每個視野細菌聚集成團，或密集黏膜上皮細胞，換算成具體數值為1010/mL以上。陰道菌群多樣性4級分級情況為：Ⅰ級(+)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別1～3種細菌；Ⅱ級(++)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別4～6種細菌；Ⅲ級(+++)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別7～10種細菌；Ⅳ級(++++)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別11種及以上細菌。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行數據分析。計數資料以率表示，不同分組間采用兩組樣本率的χ2檢驗。以Ρ<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1孕晚期婦女無乳鏈球菌攜帶情況 5 855例門診和住院病房就診的孕晚期婦女(孕34～37周)中共檢出無乳鏈球菌攜帶者563例(563/5885,9.6%)，其中陰道分泌物檢出143例(143/5 885,2.4%)，直腸分泌物檢出426例(426/5 885,7.2%)，二者同時檢出陽性有106例(106/5 885,1.8%)，占總陽性人群的18.8%。對照組中檢出陽性4例，陽性率為4.0%。

2.23組研究對象陰道清潔度、乳酸桿菌水平及陰道菌群多樣性情況 無乳鏈球菌陽性組乳酸桿菌(Ⅱ～Ⅲ級)、菌群多樣性(Ⅱ～Ⅲ級)、清潔度(Ⅰ度)、微環境失調的概率見表1。其中無乳鏈球菌陽性組、陰性組各指標與對照組相比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；陰性組各指標與對照組相比，差異亦均有統計學意義(P<0.05)。

表1 3組研究對象陰道微環境相關指標的比較[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰性組比較，#P<0.05

3 討 論

目前研究報道普遍認為，無乳鏈球菌是孕晚期婦女發生嚴重感染性疾病的主要致病菌之一，可以造成孕婦及嬰兒不良后果[7-8]。女性陰道通常被認為是一個復雜的微生態體系，乳酸桿菌含量、菌群多樣性、清潔度等因素對維持微環境的平衡和預防感染的發生起到了非常重要的作用[7,9-10]。因此，對孕晚期婦女進行無乳鏈球菌篩查，同時調查陰道微環境相關指標，結合分析后可采取積極有效的預防和治療措施，降低孕晚期婦女感染率。

微生物細菌培養鑒定是鑒別及診斷無乳鏈球菌感染的“金標準”，但其周期長、操作繁瑣、檢出率低等明顯的缺點不能很好地滿足臨床準確、快速鑒定的訴求，同時煩瑣的操作一定程度了造成了檢驗人力資源的浪費。RT-qPCR法檢測無乳鏈球菌具有快速、操作簡便、靈敏度高等特點，可以較好地解決以上問題，目前廣泛應用于無乳鏈球菌的檢測[10]。陰道微環境有一套較為完善的臨床評價體系，當陰道菌群密度為Ⅱ～Ⅲ級、多樣性為Ⅱ～Ⅲ級、清潔度為Ⅰ度、乳酸桿菌正常、陰道酸堿度為小于4.5時，定義為陰道微環境正常。當任何一項異常，均可診斷為微環境失調[11]。

本研究對孕晚期婦女采用RT-qPCR法檢測無乳鏈球菌攜帶情況，并檢測記錄微環境相關的各項指標結果。結果顯示，本院孕晚期婦女無乳鏈球菌攜帶率為9.6%，與國內報道的漢中[12]、北京[13]、重慶[14]地區的攜帶率持平，低于韓國的13.0%[10]，處于歐洲國家6.5%～36.0%和美國2.0%～29.0%[15]范圍的中下游水平。本研究顯示，孕晚期無乳鏈球菌陽性組陰道微環境失調率高于陰性組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，該結果進一步證實了育齡婦女無乳鏈球菌感染高發可能與生殖道微環境改變有關的猜測。

4 結 論

本院孕晚期婦女的無乳鏈球菌攜帶率處于已有文獻報道的正常范圍內，無乳鏈球菌感染的孕晚期婦女陰道微環境表現為失調，陰道微生態平衡遭到破壞，增加了罹患生殖道感染的風險，在臨床上應該引起足夠的重視，應該加強無乳鏈球菌的檢測和監控，以便采取預防措施，提高孕期生活質量，避免帶來嚴重后果。同時，無乳鏈球菌檢測的影響因素眾多，樣本異質性問題尤甚，分析前其過程應該加強監控。