胍丁胺的柱前衍生方法及評價

周 娟，張惠靜，胡嵐嵐 綜述，湯建林△ 審校

(1.陸軍軍醫大學第二附屬醫院臨床藥理基地，重慶 400037；2.陸軍軍醫大學藥學院藥物分析與分析化學教研室，重慶 400038)

胍丁胺是精氨酸脫羧基生成的內源性代謝產物，廣泛存在于植物、細菌及哺乳類動物的各種組織中。研究表明，胍丁胺生物學作用豐富，內源性胍丁胺及其相應的受體在中樞神經系統內構成了阿片功能的調節系統[1]；外源性胍丁胺的初步藥理學研究證明，胍丁胺能增強嗎啡鎮痛[2]，降低其成癮性及抗耐受作用[3-4]，而且抗抑郁[5-6]和抗焦慮[7]作用明顯，具有良好的研究及應用前景[8]。胍丁胺極性強、相對分子質量小，其結構中無紫外和熒光吸收基團，難以氣化，且內源性胍丁胺含量低，生物樣品中干擾成分較多，一般方法難以檢測[9]，因此，對胍丁胺的定量測定成為研究胍丁胺生物學作用亟待解決的重要問題。近年來，通過衍生化作用改變胍丁胺的極性，增大其在色譜柱上的保留，并增大分析物的相對分子質量，使之與內源性小分子雜質分離[10]，實現內源性胍丁胺的定量測定。胍丁胺的柱前衍生定量分析方法主要有柱前衍生化高效液相色譜法(HPLC)、柱前衍生化氣相色譜法、柱前衍生化色譜-質譜聯用技術等，這些方法各具特點，因而適用范圍各不相同。目前，常用的衍生化試劑包括鄰苯二甲醛(OPA)類，該試劑與胍丁胺衍生需要巰基試劑的參與，常用的巰基試劑包括巰基乙醇(ME)[11]、巰基丙酸(3-MPA)[12]、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)[13]，以及2,3-萘二甲醛(NDA)[14]、4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜噁二唑(NBD-F)[15]、氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl)[16]、乙酰丙酮(AA)類[如三氟乙酰丙酮(TFAA)、六氟乙酰丙酮(HFAA)[17]等]。本文對胍丁胺近年來常用的柱前衍生化試劑進行了總結，并對各種衍生試劑的優缺點、最佳衍生條件及檢測方法做了比較全面地分析，旨在為后期測定胍丁胺的含量及生物學研究提供方法與思路。

1 OPA

OPA是目前應用最為廣泛的衍生化試劑，在巰基試劑(如ME、3-MPA、NAC等)的作用下胍丁胺和OPA迅速反應生成具有較強熒光的異吲哚衍生物，見圖1。該反應所需條件較溫和(室溫、堿性)，反應迅速，樣品制備簡單，適用于大量生物樣品的分析測定。

圖1 胍丁胺與OPA類衍生試劑的反應方程式

1997年FENG等[11]首次利用OPA-ME作為胍丁胺柱前衍生化試劑，通過HPLC熒光檢測器測定大鼠腦內及人血漿中胍丁胺的水平。文獻中將50 mg的OPA溶解在1 mL甲醇中，加入53 μL的ME和9 mL的硼酸鉀緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=9.4)混勻，于4 ℃冰箱放置不超過3 d。衍生過程取15 μL的樣品和15 μL的OPA-ME衍生試劑在室溫條件下混合反應2 min，后立即取20 μL進樣分析。該方法選擇同型半胱氨酸為內標，靈敏度高，檢出限為0.1 pmol/L。該方法中單一樣本檢測時間長(t=80 min)，因此，并不適合用于常規檢測。蘇瑞斌等[18]利用OPA-ME柱前衍生化HPLC熒光檢測法測定大鼠不同腦區及NG-108-15細胞內胍丁胺的含量。結果顯示正常大鼠不同腦區和NG108-15細胞內胍丁胺的含量分別為0.80～1.71 μg/g濕腦組織、0.044 mg/g蛋白。宋滇文等[19]選擇微量OPA-ME柱前衍生技術，通過熒光檢測器測定大鼠脊髓組織中胍丁胺的含量，檢測限可達到3.85 pmol/L。目前OPA-ME作為胺類化合物柱前衍生試劑應用廣泛，但是OPA-ME在反相柱分離過程中部分衍生化合物會發生裂解，因此，必須嚴格控制衍生化反應的時間。

相關文獻表明，OPA-3-MPA與多胺的衍生反應迅速(<5 min)，且具有較高的靈敏度和準確度。MARKOWSKI等[12]使用OPA-3-MPA進行柱前衍生，通過HPLC熒光檢測器(λex=338 nm，λem=455 nm)測定人體尿液中精氨酸及胍丁胺在內的12種代謝產物。方法中稱取40 mg OPA溶解在0.8 mL甲醇中，加入40 μL的3-MPA和7.2 mL硼酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=9.0)混勻，于黑暗低溫中保存不超過2 d。將制備好的50 μL樣品與50 μL的OPA-3-MPA衍生試劑渦旋混合，室溫下精確反應2 min，立即取20 μL注入HPLC熒光測定系統中，胍丁胺的檢出限為28 nmol/L，保留時間為44 min。

多胺可以與OPA和NAC反應形成相對穩定的衍生產物，即OPA-NAC-多胺。DAI等[13]采用HPLC熒光檢測器，以OPA-NAC作為柱前衍生化試劑，測定豬肝臟、空腸、回腸等組織中的胍丁胺含量。試驗中稱取50 mg OPA和50 mg NAC溶解于1.25 mL甲醇中，加入40 mmol/L硼酸鈉緩沖液(pH 9.5)11.2 mL和0.4 mL Brij@-35，輕輕混勻。該衍生試劑須在HPLC分析當天新鮮配制，并避光儲存在4 ℃，24 h內使用。此方法特異性強，不受氨基酸的干擾，胍丁胺的保留時間約為9 min，檢測限為0.5 nmol/mL或0.1 nmol/mg生物樣品組織，且衍生化溶液中使用的OPA對HPLC系統沒有不利影響。據文獻報道，與含有氨基或胺基的物質發生快速衍生化反應最佳的OPA濃度為1.95 mg/mL或14.5 mmol/L。OPA-NAC衍生化反應具有簡單、快速、靈敏、重現型好等特點，可用于在線自動化柱前衍生，消除了手工操作中的錯誤，從而縮短反應產物形成到熒光檢測之間的時間間隔，適合各種不同特性的生物樣品和小體積/小量的衍生化反應，適用于農業和生物醫學領域研究多胺的精確分析[20]。

2 NDA

NDA與胍丁胺在氰化物存在下反應簡單快速，且衍生產物非常穩定，見圖2。ROBERTS等[14]利用NDA柱前衍生HPLC熒光法測定小鼠脊髓給予胍丁胺后的藥效學和藥代動力學研究，實驗中將組織提取物真空濃縮并懸浮于100 μL pH=9.4的硼酸鹽緩沖液中；加入NaCN(40 μL，0.025 mol/L)，然后加入甲醇配制的萘二甲醛(100 μL，0.05 mol/L)，在室溫下反應20 min，取5～10 μL反應混合溶液進樣。CHEN等[21]通過NDA柱前衍生化毛細管電泳結合發光二極管誘導熒光檢測(CE-LEDIF)法分離啤酒樣品中的氨基酸和胺，檢測到胍丁胺濃度為87.4 μmol/L。另外，ZHAO等[15]認為用NDA衍生胍丁胺其衍生產物對熱穩定，且具有激光誘導熒光(LIF)檢測有利的檢測波長(λex=447 nm，λem=520 nm)，但柱子對衍生物和過多的NDA保留極強，難以洗脫。

3 NBD-F

熒光標記試劑NBD-F用于柱前衍生化，所得到的衍生產物具有高的光穩定性和有利的最大激發波長(480 nm，接近氬離子激光發射器的激發波長488 nm)，因此可用激光誘導熒光檢測器(LIF)進行檢測。ZHAO等[15]利用NBD-F作為柱前衍生化試劑結合LIF檢測鼠腦、胃組織及人血漿中胍丁胺的含量反應方程見圖3，檢出限為5 nmol/L，檢測時間<10 min。研究中指出，NBD-F與胍丁胺的衍生化反應需在一定溫度下進行，如堿性環境下(pH=8.5)、溫度T=60 ℃時，反應時間為40 min。室溫條件下該衍生產物存放2 h仍保持穩定，經乙酸乙酯萃取后，于4 ℃冰箱可穩定保存數月。另外，文獻中提到，NBD-F的濃度直接影響衍生物產量，當NBD-F與胍丁胺的比例大于120∶1時，熒光信號最大。用NBD-F衍生胍丁胺的有效pH范圍為8.3～9.5，在溶液pH>9.5時，NBD-F將會發生明顯的水解反應，從而導致色譜峰拖尾嚴重。PAULSON等[22]采用超高效液相-電噴霧串聯質譜聯用技術(UPLC-ESI-MS)，以NBD-F作為柱前衍生試劑測定肺囊性纖維化患者痰樣本中胍丁胺的含量，其檢測限為40 nmol/L。總之，NBD-F衍生胍丁胺反應穩定，且熒光強度適宜，靈敏度高，可用于精確定性定量分析。但是由于該方法需要LIF或質譜聯用技術進行檢測，一般實驗室無法普及。

圖2 胍丁胺與NDA類衍生試劑的反應方程式

圖3 胍丁胺與NBD-F的反應方程式

4 FMOC-Cl

FMOC-Cl能與伯胺、仲胺在介質pH 8.5～9.5發生反應，該衍生過程速度快、產物穩定、熒光強度高、靈敏度高，是一種較為理想的氨基酸定量分析的柱前衍生化試劑。BAUZA等[16]利用FMOC-Cl柱前衍生HPLC法測定白葡萄酒中5種氨基酸和8種胺類物質的含量，在20 μL白葡萄酒樣品中加入50 μL緩沖溶液(pH=8.5)和100 μL FMOC試劑(8 mg FMOC/1 mL ACN)反應3 min后，加入300 μL淬滅劑(乙腈-乙酸-水，比例為20∶2∶3)。該方法檢測得到胍丁胺的含量為4.1 mg/L。然而，FMOC衍生有一個眾所周知的缺點，即寬試劑峰[FMOC-Cl和(或)FMOC-OH]的干擾效應。為了消除寬試劑峰的干擾，KIRSCHBAUM等[23]對衍生試劑用量、淬滅試劑最佳需要量及定量反應的最佳時間進行優化。結果表明，衍生過程中高濃度的FMOC-Cl衍生試劑和過量的淬滅試劑沒有辦法定量消除，氨基酸與FMOC-Cl的最佳反應時間為3 min，而對于具有較低反應速率的胺最佳反應時間為5 min。

5 AA

胍丁胺由于結構中沒有吸收基團，難以氣化，較難檢測。丘忠麗等[17]以HFAA作為胍丁胺的衍生試劑，采用同位素稀釋-氣相色譜-質譜法檢測大鼠血漿中的內源性胍丁胺，檢出限為0.005 7 ng/mL。與同類衍生試劑AA、TFAA相比，HFAA衍生胍丁胺產率更高，且衍生產物最穩定、揮發度高(氣化溫度降低)，從而促進了胍丁胺在氣相色譜(GC)上獲得較好的分離和檢測。DOUGLAS等[24]利用該反應產物成環具有高度揮發性和良好的電捕獲能力，通過負化學電離質譜(GC-NCI-MS)檢測鼠腦組織中的胍丁胺，保留時間為2 min，檢出限為25 fmol/L。但是該方法樣品前處理較為復雜，需經過2次液液萃取。另外,阮志鵬[25]應用HFAA作衍生試劑，乙酸乙酯作催化劑，通過氣相色譜氮磷檢測器(GC-NPD)分析大鼠血漿中的胍丁胺濃度，其最低檢測濃度為0.1 μg/mL，可用于胍丁胺的血藥濃度分析及藥代動力學研究。

6 小 結

隨著內源性胍丁胺的生物學作用日益被廣泛關注，以及外源性胍丁胺可能具有良好的新藥開發前景和價值，胍丁胺衍生化高特異度與靈敏度的定量檢測方法的建立成為眾多研究者關注的重點。分析發現，各衍生試劑與胍丁胺反應的條件不同，生成的化合物穩定性、熒光強度亦有明顯差異，筆者總結了幾種常用的衍生試劑與胍丁胺發生衍生反應的條件，見表1。

表1 不同衍生試劑與胍丁胺衍生的條件

注：-表示無此項

目前，柱前衍生化色譜/質譜技術廣泛應用于樣品中胍丁胺的檢測，常用衍生試劑包括OPA、NDA、NBD-F、FMOC-Cl等。OPA類衍生試劑與胍丁胺反應快速、簡單，過量的衍生試劑對檢測不產生干擾，衍生產物具有高度熒光。但是該類衍生試劑不與次級氨基酸發生反應；衍生試劑不穩定，通常只能保存1～2 d，臨用時須新鮮配制；衍生產物穩定性相對較差，限制了樣品預處理程序的使用，如樣品清潔和預濃縮。NDA與伯胺在氰化物存在下反應簡單快速，且衍生產物非常穩定，但柱子對衍生物和過多的NDA保留極強，難以洗脫。NBD-F與胍丁胺反應衍生產物較單一，雜質干擾少，具有極佳的光穩定性。當溶液pH>9.5時，NBD-F將會發生明顯的水解反應，導致色譜峰嚴重拖尾，所以需嚴格控制溶液的pH。FMOC-Cl能與伯胺和仲胺發生快速反應，衍生產物穩定，熒光強度高，靈敏度高。然而，FMOC-Cl不僅和氨基酸會發生多重衍生反應，而且易形成寬試劑峰干擾氨基酸分離，衍生過程中高濃度的FMOC-Cl和過量的淬滅試劑較難定量消除。HFAA與胍丁胺反應衍生物產率高、易揮發且穩定，但反應條件苛刻，需要較高溫度和較長時間。在實際胍丁胺測定過程中選擇衍生試劑需要根據自身試驗需要，綜合考慮衍生試劑是否容易獲得、穩定性、衍生反應的快慢以及衍生產物的穩定性、靈敏度、檢測限等。只有充分了解這些衍生試劑的特點，才能做出正確的選擇，從而獲得理想的測定結果。