雷帕霉素生物合成及其分子調控的研究進展

田進忠 姜衛紅 蘆銀華

(1 中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所，上海 200032；2 中國科學院大學，北京 100049；3 上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234)

雷帕霉素是由雷帕鏈霉菌(之前被稱為Streptomyces hygroscopicusATCC29253或NRRL5491)、伊氏鏈霉菌和游動放線菌N902-109等放線菌菌株產生的31元大環內酯類抗生素，生物活性非常多樣，具有抗真菌、免疫抑制、抗腫瘤、神經保護和抗衰老等多種功效[1-2]。目前，雷帕霉素及其衍生物臨床上主要用作免疫抑制劑及抗腫瘤藥物。它生物活性的多樣性極大激發了科研工作者對其分子靶點及其作用機制的研究興趣。研究證實，雷帕霉素首先結合于胞內受體FKBP12(FK506-binding protein 12)，形成FKBP12-雷帕霉素復合體，然后再與mTOR(mammalian target of rapamycin, 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)的FRB結構域結合，進而抑制mTOR與下游靶蛋白之間的相互作用[3]。mTOR的靶蛋白往往參與細胞生命活動的重要過程，這是雷帕霉素呈現廣泛生物學活性的原因所在。

雷帕霉素分子結構十分復雜，難以化學合成，主要依賴于放線菌的發酵法生產。為實現雷帕霉素的高效生物合成，許多科研工作者對其生物合成途徑及其調控機制進行了深入研究，目前其生物合成過程已被清楚解析[4-8]。首先，聚酮合酶(PKS)加載起始單元，即莽草酸途徑來源的DHCHC[(4R,5R)-4,5-dihydroxycyclohex-1-ene-carboxylic acid][5]；然后，通過14步反應依次加載7分子丙二酰輔酶A和7分子甲基丙二酰輔酶A，縮合形成聚酮鏈；接著，在非核糖體肽合成酶(NPRS)RapP的作用下，將L-派可酸與聚酮鏈縮合成環，生成雷帕霉素大環內酯母核；最后，經過細胞色素氧化酶P450的氧化、甲基轉移酶的甲基化等一系列后修飾過程，形成雷帕霉素[4-10]。另外，在雷帕霉素生物合成的分子調控研究方面也取得了不錯的進展，對其生物合成基因簇內部的5個調控基因進行了功能鑒定，并對其可能的調控機制開展了初步研究[11-12]。這些研究成果為運用基因工程或代謝工程手段進行雷帕霉素高產菌株的分子育種奠定了良好的基礎。

本文將重點介紹雷帕霉素生物合成基因簇、生物合成途徑及其調節機制研究方面的最新研究進展，并將就該重要抗生素產品的發現及其類似物的功能、高產菌株育種等方面的研究進行簡要回顧，同時，也對未來雷帕霉素高產菌株的分子育種以及新型類似物的開發進行了展望。

1 雷帕霉素及其衍生物的發現與功能

1964年，科學家從雷帕努伊(Rapa Nui，復活節島)的土壤樣品中分離得到產生抗真菌活性產物的菌株，并將該活性物質以雷帕努伊命名，稱為雷帕霉素。1975年，Vézina等[13-15]研究者在Ayerst研究所分離鑒定了雷帕霉素的產生菌，屬于吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus，后被命名為雷帕鏈霉菌)。起初，雷帕霉素顯示出很強的抗人類致病性酵母的活性，進一步研究發現該抗生素及其類似物可以抑制多種真菌的生長，包括新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、念珠菌(Candida stelloidea)和青霉菌(Penicilliumsp.)[16-18]。因此，雷帕霉素作為一種抗真菌劑逐漸走進人們的生活。除了抗真菌活性以外，Ayerst研究所科研人員發現該化合物還具有極強的免疫抑制活性。在大鼠模型中，雷帕霉素可抑制實驗性免疫病(過敏性腦脊髓炎和佐劑性關節炎)的發展及IgE抗體的形成，從而發揮其免疫抑制作用；深入研究表明，它是通過抑制細胞免疫應答而發揮免疫抑制功能[19]。隨后，該抗生素作為人類器官移植術后的免疫抑制劑進入臨床應用。雷帕霉素作為免疫抑制劑具有獨特的優勢，比鈣調神經磷酸酶抑制劑-環孢菌素A作用強10～100倍[20]。不僅可以有效抑制急性器官移植免疫排斥反應，還可以有效抑制FK506和環孢菌素A不能抑制的慢性器官移植免疫排斥[21-22]，同時避免了環孢霉素引發腫瘤的可能性。另外，如將它和其他免疫抑制劑(如環孢菌素)聯合使用，抗免疫排斥效果會更好，可有效抑制急性腎同種異體移植免疫排斥反應，并減少對腎的毒害[23]。

雷帕霉素及其類似物還具有很強的抗惡性腫瘤作用，與癌癥化療藥物聯合使用，可顯著提高對癌細胞的殺傷力。報道顯示，與順鉑或紫杉醇聯合應用可以有效抑制子宮內膜癌細胞的生長[24-25]。在小鼠模型中，使用四甲氧基愈創木酸(tetra-O-methyl nordihydroguaia-retic acid)與雷帕霉素聯合治療，其存活率顯著提高[26]。如今，研發的第二代半合成雷帕霉素衍生物(圖1)，如替西羅莫司(Wyeth, 3)和依維莫司(Novartis, 4)，與雷帕霉素相比，具有更有效的藥代動力學性質，并且毒性更低。這些衍生物已經被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準作為治療腎癌和惡性淋巴腫瘤的臨床用藥[27]。隨著對雷帕霉素研究的深入，發現它還具有神經保護和促進神經再生等功能。在體外和體內神經變性模型中，它可以減弱泛素化蛋白聚集和降低神經元損傷，這對于由蛋白的錯誤折疊和聚集引起的疾病(如帕金森病)提供了一個有希望的治療策略[28-29]。雷帕霉素也可以減弱小鼠脊髓損傷后病理性神經疼痛的發展[30]。此外，其半合成衍生物佐他莫司(5)(圖1)可以有效預防血管萎縮。佐他莫司是四唑環取代雷帕霉素C-42位的羥基，它被血液緩慢輸送到冠狀血管壁支架周圍防止血管萎縮變窄，同時不引起炎癥反應[31]。2013年，FDA已批準佐他莫司作為穩定冠狀動脈支架的藥物進入臨床應用。

更有趣的是，雷帕霉素在模式生物酵母、線蟲、果蠅和小鼠中都能顯著延長其壽命。2009年，Harrison等[32]發現給600天齡(約相當于人類60歲)的小鼠喂食雷帕霉素可以延長其壽命，雄鼠和雌鼠均有明顯效果，分別為9%和14%。后續的研究發現給270天齡的小鼠喂食雷帕霉素，同樣可以顯著提高存活時間，雄鼠和雌鼠的最大壽命分別延長16%和13%。

圖1 雷帕霉素及其類似物的化學結構Fig.1 Chemical structures of rapamycin and its rapalogs

2 雷帕霉素生物合成基因簇及其合成途徑

圖2 雷帕霉素生物合成基因簇Fig.2 The map of the rapamycin biosynthetic gene cluster

1995年，Schwecke等[7]利用一段紅霉素生物合成基因簇來源的聚酮合酶(PKS)序列為探針，從雷帕鏈霉菌基因組文庫中，篩選得到含有雷帕霉素合成基因簇的文庫質粒，通過測序、拼接得到完整的雷帕霉素生物合成基因簇(圖2)。基因簇全長107.3kb，共有26個ORF(open reading frame，開放閱讀框)(表1)，其中rapK編碼分支酸酶，在起始單位DHCHC的合成過程中發揮重要功能；rapA、rapB和rapC編碼3個I型PKS，rapP編碼非核糖體肽合成酶(NRPS)[33-34]。PKS含有以下模塊化的功能結構域：羧酸連接酶(carboxylic acid ligase, CoL)、烯酰還原酶(enoyl reductase, ER)、β-酮脂酰合成酶(β-ketoacyl synthase, KS)、酰基轉移酶(acyltransferase, AT)、脫水酶(dehydratase, DH)、β-酮脂酰還原酶(β-ketoacyl reductase, KR)和酰基載體蛋白(acyl carrier protein, ACP)。3個PKS復合體共含有15個催化模塊，包括1個合成起始模塊和14個延伸模塊，每個延伸模塊催化1個延伸單位連接到雷帕霉素的聚酮鏈上(圖3)。RapP催化L-哌可酸和聚酮鏈的成環反應，形成前雷帕霉素(pre-rapamycin)。L-哌可酸由賴氨酸環化酶RapL催化L-賴氨酸形成。最后，在RapIJMNOQ等后修飾酶(主要為甲基轉移酶、P450)的催化下，前雷帕霉素第9、16、27、39號位發生后修飾，最終生成雷帕霉素(圖3)。RapXWV為ABC轉運子，可能與雷帕霉素的自身抗性有關。簇內尚有多個功能未知的基因，包括rapD、rapE、rapF、rapV、rapW、rapU、rapT和rapZ(其預測功能見表1)[35]。

表1 雷帕霉素基因簇(來源于雷帕鏈霉菌)的基因及功能Tab. 1 The rapamycin biosynthetic genes (from S. rapamycinicus)and their functions

雷帕霉素的生物合成途徑可以分為聚酮鏈合成的起始、延伸、環化和后修飾4步，簡單描述如下：

2.1 聚酮鏈合成的起始

雷帕霉素合成的起始單元DHCHC來源于莽草酸途徑。分支酸在RapK的催化下形成DCDC(3,4-dihydroxycycloheax-1,5-diene-1-carboxylic acid)，進一步形成DHCHC，但是DCDC是如何轉化成DHCHC的，尚有待解析[5,9]。DHCHC在羧酸連接酶的催化下被ATP活化形成AMP-DHCHC二元復合物，之后轉移到活化的ACP上，由此開始聚酮鏈延伸。ACP是PKS合酶的關鍵結構域，在磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPTase)的催化下從輔酶A獲得磷酸泛酰巰基乙胺基(PPT)從而活化[35]。

分支酸在RapK的催化下合成DCDC，再以DCDC為底物合成雷帕霉素起始單元DHCHC。PKS(RapA、RapB、RapC)催化聚酮鏈的起始和延伸；RapL催化L-派克酸的形成；RapP催化聚酮鏈和L-派克酸的環化；RapIJMNOQ分別催化相應位點的后修飾。

2.2 聚酮鏈的延伸

在RapA、B和C 3個PKS、14個延伸模塊的催化作用下，以一定的順序通過縮合反應將7分子的丙二酰輔酶A和7分子的甲基丙二酰輔酶A依次連接到聚酮鏈上。同時，每個模塊上不同的功能結構域：ER、KS、AT、DH 、KR等催化相應位點的加氫和脫水反應(圖3)。模塊3和模塊6上的功能結構域被認為是失活的，因為相對應的羰基沒有被催化[36]。

2.3 聚酮鏈的環化

聚酮鏈的環化是在RapP的催化作用下完成的。RapP將L-哌可酸(L-pipecolic acid)連接到雷帕霉素聚酮鏈上，環化形成前雷帕霉素[37]。RapP催化反應沒有嚴格的底物專一性，它也可以催化脯氨酸和雷帕霉素聚酮鏈的環化形成脯氨酰雷帕霉素[33](圖1)。L-哌可酸來源于L-賴氨酸，此反應由賴氨酸環化酶RapL催化完成[6,8]。

2.4 前雷帕霉素的后修飾

雷帕霉素的生物合成存在復雜的后修飾過程，負責前雷帕霉素后修飾的基因共有6個(rapI、rapJ、rapM、rapN、rapO和rapQ)。其中，rapI、rapM與rapQ編碼甲基轉移酶；rapJ和rapN編碼細胞色素P450單加氧酶；rapO編碼鐵氧還蛋白。Gregory等[35]運用基因敲除和互補實驗，結合發酵產物的鑒定，推測了前雷帕霉素后修飾的過程，按先后順序依次為：a：RapI(O-甲基轉移酶)催化39位羥基的甲基化；b：RapJ(P450)催化C9位的加氧反應，形成羰基；c：RapM(O-甲基轉移酶)催化16位羥基的甲基化；d：最后，RapN(P450)與RapQ(甲基轉移酶)分別催化27位C的羥基化及甲基化；其中RapJ和RapN加氧反應(C9和C27)需要鐵氧還蛋白RapO的參與。前雷帕霉素經過以上一系列后修飾，最終形成雷帕霉素(圖3)。C9、C16 與C39位的甲基均來源于甲硫氨酸。

圖3 雷帕霉素生物合成途徑示意圖Fig.3 Schematic map of the rapamycin biosynthetic pathway

值得一提的是，不同產生菌來源的雷帕霉素生物合成基因簇存在一定的差異。1995年，日本靜岡縣發現了一種新的產雷帕霉素的菌株游動放線菌(Actinoplanessp. N902-109)，該菌產雷帕霉素的能力是雷帕鏈霉菌的近10倍[38]。最近，對兩株菌中的雷帕霉素生物合成基因簇序列進行比較分析，發現PKS基因(rapA、rapB和rapC)和rapP在兩個基因簇中的分布完全一致，其余基因也高度同源[39]。但參與前體合成和前雷帕霉素后修飾基因的分布位置則明顯不同。有趣的是，游動放線菌N902-109來源的基因簇中不存在負調控基因rapS/R和rapY，同時存在ActrapTH編碼的酯酶II，它可能參與編輯PKS，該酶的作用可能是N902-109雷帕霉素高產的原因所在，但卻不存在于雷帕鏈霉菌來源的基因簇中。另外，在N902-109中，編碼甲基轉移酶的rapM基因多了一個拷貝，但沒有發現存在于雷帕鏈霉菌基因簇的rapQ(編碼甲基轉移酶)和rapG的同源基因(圖2)[39]。

3 雷帕霉素生物合成的分子調控

現有關于雷帕霉素生物合成的分子調控均在雷帕鏈霉菌中完成的，通過分析雷帕鏈霉菌中雷帕霉素的生物合成基因簇序列，5個ORF被預測為調控基因，包括rapG、rapH、rapS、rapR和rapY(圖2，表1)，研究發現它們在雷帕霉素合成過程中發揮不同的調控作用[11-12,40]。

在雷帕鏈霉菌NRRL5491中，增加rapG或者rapH基因拷貝數可以顯著提高雷帕霉素產量；反之，如將基因敲除則導致產量顯著下降，由此證實它們在雷帕霉素合成過程中發揮正調控作用。序列比對結果顯示，RapG和RapH分別屬于AraC和LAL家族的調控因子。RapG含有一個位于C端的HTH(螺旋-轉角-螺旋)，與來自大腸埃希菌的調控因子SoxS同源，但缺乏多數AraC家族調控蛋白擁有的位于N端的二聚化結構域。RapH含有2個結構域，分別是位于C末端和N末端的HTH DNA結合結構域和ATP結合結構域。RapH與來自另一種免疫抑制劑FK506生物合成基因簇的正調控因子FkbN基因序列顯示出高度的相似性(72%)[43-44]。RapG和RapH作為雷帕霉素合成的正調控因子，它們協同調控著雷帕霉素的生物合成，其中RapG占主導作用，而RapH僅發揮輔助功能[12]。另外，這2個正調控因子的DNA編碼序列中均含有放線菌稀有密碼子TTA，因此，它們的翻譯必須依賴于bldA(編碼TTA的轉運tRNA)[12,42-44]。

rapR、rapS和rapY為雷帕霉素生物合成的負調控基因[11]。rapR/S編碼一對雙組分系統(twocomponent system, TCS)，包括應答調控蛋白RapR和組氨酸蛋白激酶RapS，它們與變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)來源的TCS CutR-CutS和天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的TCS AfsQ1-AfsQ2具有較高同源性[45-46]。rapY編碼屬于TetR家族的調控蛋白RapY，是抗生素外排抑制子，它含有一個位于N末端的HTH DNA結合結構域，與來源于放線紫紅素(actinorhodin)合成基因簇的actII以及特曲霉素(tetracenomycin)合成基因簇的tcmR同源性較高[11]。3個負調控基因的分別過表達均導致雷帕霉素產量的顯著下調，而將rapS或rapY缺失可以大幅提高雷帕霉素的發酵產量(分別提高4.6與3.7倍)。由于RapS與RapR是一對雙組分系統，可以斷定RapS的功能是通過其匹配的應答調控蛋白RapR來實現的。轉錄分析表明，RapS/R對rapY的轉錄行使抑制功能，而RapY則負調控rapX的轉錄。rapX編碼一種ABC-轉運蛋白，它可能通過外排雷帕霉素進而防止產物積累對細胞本身的毒害作用。另外，在rapS缺失的菌株里過表達rapX，可以進一步提高雷帕霉素的產量，與原始株產量相比，提高幅度達6.7倍[11]。

綜上，我們可以看到，關于雷帕霉素生物合成的分子調控均停留在基因簇內分布的調控因子，而對于基因簇外調控因子參與雷帕霉素生物合成的研究至今未見報道。但考慮到基因簇外調控因子往往行使多效性或全局性調控功能，而且在不同鏈霉菌中相對比較保守，因此，來源其他鏈霉菌的全局性調控因子的研究信息可以應用到雷帕鏈霉菌的代謝工程分子改造中，或許會取得不錯的改造效果。

4 優化雷帕霉素發酵水平的策略

表2 不同碳源、氮源對雷帕霉素產量的影響Tab. 2 Effects of different carbon and nitrogen sources on rapamycin production

在雷帕霉素發酵研究初期，研究者在培養基優化方面開展了大量工作，為雷帕霉素的產量提升做出了很大貢獻，這些工作主要是由Arnold Demain博士的研究團隊[47]完成的。他們測試了35種不同碳源(包括多糖、單糖、寡糖以及有機酸)對雷帕霉素產量的影響，結果顯示，纖維二糖、果糖、半乳糖、肌醇、甘露糖、甘露醇和木糖均可導致其產量的增加(表2)。同樣測試了氨基酸作為氮源對產生菌的生長和雷帕霉素產量提升的效果(表2)，發現在發酵培養基里添加天冬氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸組合對菌種生長以及雷帕霉素的產量提升效果顯著[48]。在以上培養基條件下，L-賴氨酸的添加將能夠大幅提高產量(提高1.5倍)，產量達到134mg/L，這可能是因為L-賴氨酸的添加可以增加雷帕霉素合成的前體物質L-哌可酸所致。而甲硫氨酸和苯丙氨酸則抑制它的生物合成。推測甲硫氨酸可能抑制雷帕霉素生物合成相關的O-甲基轉移酶和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶的活性，從而降低雷帕霉素的產量[49]；而苯丙氨酸抑制雷帕霉素合成的機制還沒有得到解析。Cheng等[50]還測試了磷酸鹽、銨鹽、鎂與鐵離子對雷帕霉素合成的影響，他們發現磷酸鹽(K2HPO4)、銨(NH4Cl)、鎂(MgSO4·7H2O)會抑制它的生物合成；相反，濃度為100mg/L(0.36mmol/L)的FeSO4(高于雷帕鏈霉菌生長所需的二價鐵濃度)卻能刺激了雷帕霉素的合成。為了更系統地優化培養基營養成分，Sinha等[51]利用Plackett-Burman設計方法和人工神經網絡等方法，通過在發酵的不同時段添加營養成分，響應雷帕霉素合成的代謝需求，將其產量提高到320.89mg/L。

雷帕霉素發酵產量低，一個核心的問題是缺少優良的菌種。因此，開展高產菌株的育種研究是必需的。傳統的育種方法是主要使用理化誘變策略，如紫外線(UV)照射和亞硝基胍(NTG)誘變等，通過大批量篩選獲得雷帕霉素高產菌株。例如，Baby Rani等[52]將吸水鏈霉菌進行NTG誘變，經過篩選獲得一株產量達210mg/L的突變菌株MTCC5681，相對于原始菌株(45mg/L)，產量提高了5倍。在此基礎上，他們還做了發酵條件的優化，突變菌株的發酵產量又提高了1.6倍，達到了360mg/L。Cheng等[53]發現，通過慶大霉素處理雷帕霉素產生菌的原生質體，可以有效獲得高產菌株。在該研究中，他們篩選到一株高產突變體C14-1，它的產量比出發菌株高60%；結合NTG誘變處理，獲得另一株突變體C14-2，其產量進一步提高到195mg/L，比親本菌株增加124%。另外，理化誘變結合原生質體融合技術也被應用于雷帕霉素高產菌株的育種研究中。Chen等[54]運用此項技術，在通過種內原生質體融合和種間原生質體融合獲得7株相對高產菌株的基礎上，再經過一輪Genome shuffling結合高通量篩選手段，從33216個菌株中篩選到1株雷帕霉素產量高達445mg/L的突變菌株GS-1437。Xu等[55]通過96孔微量滴定板篩選了7000個菌株，其中一株高產菌株的雷帕霉素產量達420mg/L。

在過去幾年中，也有通過基因工程或代謝工程手段以提高雷帕霉素發酵產量的研究報道，但相對較少。例如，Huang等[56]在吸水鏈霉菌TYQ0915中異源整合表達了來自阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的LAL家族轉錄調控因子aveR，可以使雷帕霉素的發酵產量提高了2倍，達到1.5mg/g；Geng等[57]通過在ATCC29253中敲除pfk(6-phosphofructokinase基因)同時過表達dahP(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase基因)和rapK，使雷帕霉素產量提升了142.3%，達到250.8mg/L。Jung等[58]以吸水鏈霉菌ATCC29253為出發菌株，通過紫外誘變得到突變體UV2-2，并在UV2-2中過表達pcc(propionyl-CoA carboxylase基因)的同時添加丙酸，可使雷帕霉素的產量達到42.8mg/L；但是，過表達甲基丙二酰-CoA變位酶(methylmalonyl-CoA mutase)和甲基丙二酰-CoA連接酶(methylmalonyl-CoA ligase)效果不顯著。

發酵過程中的動力學參數也顯著影響雷帕霉素的發酵產量[59-60]。最近研究顯示，提供純氧和低攪拌速率可以避免對鏈霉菌顆粒的剪切，在這種條件下雷帕霉素產量最高可達到780mg/L[59]。此外，一項研究評估了吸水鏈霉菌MTCC4003雷帕霉素生產的動力學參數，這項研究在最佳的發酵條件下(300r/min攪拌速率和1vvm發酵罐中的通氣速率)使用可靠的數學模型(其參數包括最大比生長速率、飽和常數、抑制常數和生長產量系數)，最終在2.2L生物反應器中得到1316mg/L的雷帕霉素，這是在文獻報道的分批發酵中獲得的最高雷帕霉素產量[64]。

5 總結與展望

雷帕霉素問世已50年有余，從作為抗真菌劑被發現，逐漸成為用量低、藥效高、低毒性的免疫抑制劑，如今人們正在發掘它在神經保護、抗腫瘤和抗衰老方面的功能。由于它的多重功效，尤其是作為抗癌藥物，有理由相信未來對它的需求量將逐年上升。鑒于雷帕霉素結構復雜，不適合化學合成，將來仍將依賴于發酵生產，因此迫切需要研發優良的生產菌株。雖然運用傳統理化誘變育種技術結合發酵工藝優化提升了雷帕霉素的發酵水平，但是這種方法費時費力。隨著其生物合成途徑得到全面解析以及雷帕霉素產生菌遺傳操作體系的不斷完善[61]，為我們發展基于代謝工程理念的分子育種提供了可能。雷帕霉素的合成亦受到復雜的調控，這也是工業生產菌種發酵單位偏低的原因之一。但是，對于這方面的研究還很薄弱，深入開展雷帕霉素生物合成的分子調控研究，解析其復雜的調控網絡，將為生產菌種的改造提供重要的理論指導。

另外，生物信息學分析顯示，雷帕鏈霉菌基因組上存在多達52個次級代謝產物生物合成基因簇[62]。多種產物(尤其是同一類型的次級代謝產物)在生物合成過程中會互相競爭前體、輔因子、能量和還原力，勢必會削弱目標產物的合成。因此，敲除競爭性產物的合成途徑是有效提高目標產物合成效率的策略之一[63-64]。最近，作者所在實驗室發展了基于CRISPR/Cas9和Cpf1的基因組編輯技術，可以快速、高效地進行基因簇的缺失或中斷[65]，這些方法的建立為通過阻斷競爭途徑構建雷帕霉素高產菌株提供了便利。

基因簇多拷貝擴增現象廣泛存在于經傳統誘變育種技術獲得的抗生素高產菌株基因組中，如青霉素(penicillin)、卡那霉素(kanamycin)、林可霉素(lincomycin)的高產菌株[66-68]。受到這種發現的啟發，已成功開發了基于基因簇多拷貝擴增技術的分子育種技術，顯著提高了放線紫紅素(actinorhodin)和井岡霉素(validamycin)的發酵產量(分別提高20倍和0.34倍)[69-70]。此外，核糖體工程(ribosome engineering)已被證明是提高鏈霉菌中次級代謝產物產量的有效手段。例如，在天藍色鏈霉菌中依次引入鏈霉素、慶大霉素和利福平三重抗性，突變體的抗生素產量是出發菌株的48倍[75]。因此，可以嘗試使用核糖體工程和基因簇多拷貝擴增等策略來提高雷帕霉素的發酵水平。

最近，科研工作者在雷帕霉素的結構改造研究方面也取得了較大的進展。Barrie等[36]開發了一種新的組合合成方法：使用聚酮合酶基因的一段序列(約2kb)，通過模塊間的隨機同源重組，生成一系列新的模塊丟失或擴增的聚酮合酶基因，從而一次性拿到多種母核縮短或延伸的雷帕霉素類似物。如需開發更加高效快速的組合生物合成方法，則還要對PKS的結構和功能進行深入解析，構效關系的闡明將為新型雷帕霉素類似物的挖掘提供極大的便利。

隨著技術的進步和對雷帕霉素認知的不斷積累，關于雷帕霉素的研究不會終止在這里，希望未來能開發出更加先進的技術用于雷帕霉素類似物的發現，使其具有更好的功能和更精確的靶向性。同時，也可用于構建更高產的雷帕霉素生產菌株。近年來，隨著系統生物學、合成生物學和代謝工程的快速發展，為提高雷帕霉素的生物合成效率以及開發雷帕霉素類似物提供了更多的途徑。