紫外分光光度法快速測定慶大霉素C1a含量在高通量篩選中的應用

田江濤 李敏超 杭海峰 郭美錦 儲炬 莊英萍

(華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

慶大霉素(gentamicin, GM)屬于氨基糖苷類抗生素，對革蘭陽性菌和陰性菌具有廣譜抗菌活性[1]。慶大霉素C1a是慶大霉素單組分之一，是合成依替米星(etimicin, ETM)的重要前體物質[2]，依替米星具有抗菌活性高、療效好、低毒性等優點而備受關注[3-6]。目前慶大霉素C1a主要通過慶大霉素多組分分離純化得到，本實驗室利用生產慶大霉素單組分C1a的絳紅小單孢菌工程菌株，可發酵產出單一組分且含雜質較少的慶大霉素C1a。但該菌株產量較低，菌種穩定性差，影響發酵效益。

高通量篩選技術常用于藥物篩選、微生物作用機理研究、酶制劑定量分析等[7-10]。在高通量篩選技術篩選慶大霉素C1a誘變菌株過程中，慶大霉素C1a的快速檢測是影響高通量篩選效率的瓶頸。由于慶大霉素C組分的分子結構中不含共軛雙鍵，無紫外吸收峰，不能使用常規的方法進行檢測，目前應用慶大霉素的檢測方法來測定慶大霉素C1a的含量[11]。慶大霉素檢測方法有濁度法、生物法、高效液相色譜法、薄層層析法等。實驗室常用的檢測方法是柱前OPA衍生樣品，使該樣品具有官能團，然后通過高效液相色譜法測定其含量。在高通量篩選誘變菌株過程中，需要對多個樣品進行處理，常規的檢測方法不利于大量樣品的快速檢測，需要建立慶大霉素C1a的快速檢測方法。

提高抗生素發酵生產效價的源頭是獲得高產菌株，近年來關于成功獲得高產菌株的報道很多[12-15]，但是關于慶大霉素單組分C1a生產菌誘變和高通量篩選的相關文獻很少。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發菌株

絳紅小單孢菌(Micromonospore purpurea)由河南仁華生物科技有限公司(平頂山)提供。

1.1.2 培養基

(1)斜面培養基組成(g/L)：淀粉10，KNO31，K2HPO4·3H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，L-天冬酰胺 0.02，CaCO31，麩皮17，瓊脂粉14，pH7.8，121℃高壓濕熱滅菌30min。

(2)種子培養基(g/L)：玉米粉15，淀粉10，葡萄糖1，低溫豆粉10，蛋白胨2，KNO30.5，CaCO35，121℃高壓濕熱滅菌30min。

(3)發酵培養基(g/L)：玉米粉15，淀粉31，葡萄糖5，高溫豆粉31，CaCO31，羽毛粉2，KNO30.5，(NH4)2SO40.6，CoCl2·6H2O 0.01，121℃高壓濕熱滅菌30min。

(4)平板培養基(g/L)：淀粉10，KNO31，K2HPO4·3H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，L-天冬酰胺 0.02，CaCO31，麩皮17，瓊脂粉14，pH7.8，121℃高壓濕熱滅菌30min。

1.1.3 試劑

慶大霉素C1a標準品(河南仁華生物科技有限公司，純度為91.59%)；硼酸(分析純)；硫酸(分析純)配制成質量分數為50%的溶液；磷鎢酸鈉(分析純)配制成1×10-2g/mL水溶液；慶大霉素C1a標準溶液濃度為1000u/mL。

1.2 方法

1.2.1 慶大霉素C1a含量測定(紫外分光光度法)

(1)發酵液預處理：將一定質量的草酸加入發酵液中，玻璃棒攪拌，測得pH值為4.0～5.0，用膠頭滴管滴加50%硫酸溶液，使pH值為1.5～1.7之間。40℃水浴鍋中反應1h。將酸化的發酵液加入10mL離心管，放入低速離心機中，轉速為4000r/min，離心10min，取上清液，待用。

(2)檢測波長確定：分別取1.5mL pH值為3的磷鎢酸鈉水溶液與1.5mL pH值為3的酸化后發酵液上清液，加入100mL的容量瓶中，混合均勻，定容至100mL。各取200μL樣品加入96孔石英酶標板中，在酶標儀中進行光譜掃描，測定不同波長條件下磷鎢酸鈉溶液和發酵上清液的吸光值。通過特征吸收峰的最大吸光值確定檢測波長。

(3)反應溫度和反應時間的確定：在100mL容量瓶中加入1.5mL磷鎢酸鈉溶液與1mL慶大霉素C1a標準品溶液，定容至100mL。將反應溫度設置為15、25和30℃。在波長為248nm條件下，測定反應時間為2、4、8、16、30和60min的上清液吸光值。

(4)標準工作曲線的建立：分別取0.1～2mL效價為1000u/mL的慶大霉素C1a標準溶液，放置于100mL容量瓶中，加入1.5mL濃度為1×10-2g/mL的磷鎢酸鈉水溶液，定容至100mL，靜置0.5h，取200μL上清液，置于96孔石英酶標板中，在248nm的波長條件下測定上清液的吸光值。以慶大霉素C1a效價為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作磷鎢酸鈉吸光度與慶大霉素C1a效價的標準曲線。

1.2.2 慶大霉素C1a含量測定(高效液相色譜法)

按照中國藥典2015年版，高效液相色譜法(通則0512)測定慶大霉素C組分含量的方法測定其含量[11]。

1.2.3 菌種的不同誘變方法

(1)ARTP誘變：通過血球計數板對孢子懸浮液進行計數，制備108個/mL的單孢子懸浮液。用移液槍取20μL均勻涂布在鐵環中央，在誘變距離為2mm條件下，參考ARTP誘變的相關文獻[16]，設定誘變時間為30、60、90、120、150、180和300s，對照組不進行照射誘變。取980μL的無菌水，將鐵環的孢子清洗至1.5mL離心管中，分別將對照組和實驗組的孢子懸浮液進行梯度稀釋，取每個濃度梯度100μL菌液均勻涂布于篩選平板中，每個濃度梯度做3組平行實驗。在36℃，濕度40%～60%條件下，培養10d。培養結束后，對同濃度梯度培養皿中的菌落數進行計數，計算誘變致死率。將對照組的單菌落與誘變菌株單菌落分別接入含有種子培養基的24孔板中，設置溫度為36℃，濕度40%～60%，搖床轉速為250r/min，培養48h；以10%的接種量，接入對應的24孔板發酵培養基中，設置溫度為36℃，濕度40%～60%，搖床轉速為250r/min，培養96h。對發酵產物進行酸化處理，通過紫外分光光度法，快速測定樣品的含量。對數據進行統計分析，計算正突變率，確定ARTP誘變時間。

(2)微波誘變：在超凈工作臺中，取100μL的108個/mL單孢子懸浮液置于1.5mL的EP管中，放入微波爐中，設定功率為600W，參考微波誘變的相關文獻[17]，設定誘變時間為30、60、90、120、150、180和300s。取900μL的無菌水將誘變菌株洗出，將未誘變孢子懸浮液和不同誘變時間的菌體進行梯度稀釋，每個梯度的懸浮液取100μL均勻涂布于篩選平板中，每個濃度梯度做3組平行實驗。在36℃，濕度40%～60%的條件下，培養10d。培養結束后，對同濃度梯度培養皿中的菌落數進行計數，計算誘變致死率。將單菌落接入24孔板中進行培養，測定慶大霉素C1a的含量，統計獲得正突變株的個數，計算微波誘變的正突變率，確定微波誘變時間。

(3)LiCl誘變：在超凈工作臺中，在1.5mL的EP管中加入500μL濃度為20%的氯化鋰溶液和500μL孢子數為108個/mL的單孢子懸浮液。誘變時間分別為5、10、15和20min。吸取100μL不同誘變時間的單孢子懸浮液，涂布于篩選培養基中，通過培養獲得單菌落，計算致死率。單菌落在24孔板培養，測定樣品含量，計算正突變率，從而確定LiCl誘變時間。

(4)ARTP和LiCl復合誘變

將500μL濃度為10%的氯化鋰溶液加入500μL孢子數為108個/mL的單孢子懸浮液中，振蕩混合5min，取20μL的LiCl誘變的單孢子懸浮液進行ARTP誘變，誘變時間為60、90、120、150和180s。通過梯度稀釋的方式將復合誘變的單孢子懸浮液稀釋至103個/mL，取100μL加入篩選培養基中。計算致死率和正突變率。確定ARTP和LiCl復合誘變的條件。

1.2.4 高通量篩選誘變菌株

(1)初篩：將濃度為108個/mL的單孢子懸浮液，通過不同方式進行誘變。稀釋一定倍數，分散涂于平板培養基中進行培養。挑選生長旺盛，面積小且突起的孢子，接入24孔板中進行種子培養43h。一方面以10%的接種量接入24孔板發酵培養基進行發酵培養；另一方面取100μL種子液，接入孔板斜面中，進行斜面培養。通過紫外分光光度法，快速檢測24孔板中發酵液效價，標注產量高于對照組的菌株所對應的孔板斜面，進行復篩。

(2)復篩：將初篩獲得的高產菌株與對照組菌株的斜面接入500mL三角瓶中，進行搖瓶培養。通過紫外分光光度法檢測搖瓶中慶大霉素C1a的含量，篩選含量高于對照組效價10%的菌株進行下一步的菌株穩定性實驗。

(3)穩定性驗證：將高產的菌株進行傳代培養，連續培養5代，記錄每一代的效價變化。挑選穩定性好且效價高的誘變菌株。將活化的種子，按照10%的接種量，加入發酵搖瓶中進行第一代培養。發酵進行48h時，在超凈工作臺中，取出對數期的種子液，按照10%的接種量，加入發酵搖瓶中，進行第二代培養。第一代發酵培養96h后，檢測發酵產物效價，連續進行五代培養。

1.2.5 高產穩定性菌株5L發酵罐培養

在5L發酵罐中，對高產穩定性菌株和出發菌株進行分 批發酵。通過測定菌濃、殘糖量、攝氧率(oxygen uptake rate, OUR)、溶氧和產物效價等過程參數，考察誘變菌株的代謝特性，初步分析高產原因。

2 實驗結果與討論

2.1 慶大霉素C1a快速檢測方法的建立

2.1.1 反應上清液pH對吸光度的影響

通過滴加H2SO4和NaOH溶液調節磷鎢酸鈉溶液與慶大霉素C1a標準液的反應上清液的pH值。不同pH磷鎢酸鈉反應上清液吸光值的光譜掃描圖如圖1所示。

實驗結果表明，pH為1時吸收峰在265nm處；當pH為2時，吸收峰在255nm處；pH在3～7的范圍內，反應上清液吸收峰在248nm；當pH值大于7時，上清液無特征吸收峰，慶大霉素C1a與磷鎢酸鈉溶液反應不產生白色沉淀物質。上述結論與pH對紫外分光光度法檢測慶大霉素波長的影響基本一致[18]。另一方面pH在3～6時，特征吸收峰在248nm的反應體系比較穩定，特征峰的吸光值和波長變化不大。當樣品與磷鎢酸鈉反應后pH值為3～6時，該方法可適用于反應體系的檢測。

2.1.2 檢測波長確定

對pH值為3的磷鎢酸鈉溶液和發酵上清液進行光譜掃描，根據磷鎢酸鈉溶液的特征吸收峰來確定檢測波長。實驗結果如圖2所示。

實驗結果表明在波長為240～260nm范圍內，磷鎢酸鈉溶液具有特征吸收峰，發酵上清液則沒有吸收峰。并且在波長為248nm時，磷鎢酸鈉與發酵液的吸光度差值最大。因此確定合適的測定波長為248nm。

圖1 不同pH條件下反應上清液的光譜掃描圖Fig.1 The spectra of the supernatant with different pH values

圖2 不同波長條件下的吸光度Fig.2 The absorbance at different wavelengths

表1 溫度和時間反應變化對吸光度的影響Tab.1 The effects of temperature and reaction time on absorbance

圖3 分光光度法慶大霉素C1a測定標準曲線Fig.3 The standard curve of gentamicin C1a detection by spectrophotometry

2.1.3 反應時間和反應溫度對吸光值的影響

反應時間和溫度是影響化學反應達到平衡的兩個重要因素。慶大霉素C1a與磷鎢酸鈉溶液反應，生成白色沉淀物質。在反應過程中反應速度與反應溫度有關，產物穩定性與反應時間相關。實驗結果如表1所示，在相同反應時間條件下，不同溫度的吸光度數值無明顯變化，可以將室溫(25℃)作為反應溫度。在一定溫度條件下吸光度隨著時間的增加而逐漸減小，在30min時，吸光值趨于恒定值。在最初的幾分鐘，吸光值下降較快，說明溶液快速反應，反應體系不穩定，在30min之后，吸光值保持一定值，溶液穩定。綜上所述，確定反應液的反應溫度為室溫(25℃)，反應時間為30min。實驗結果與相關文獻報道結果相同[18]。

2.1.4 慶大霉素C1a標準工作曲線

在波長為248nm條件下測定磷鎢酸鈉與慶大霉素C1a反應上清液的吸光值。以慶大霉素C1a效價為橫坐標，上清液的吸光度為縱坐標，繪制慶大霉素C1a的標準工作曲線。

由圖3可知，當慶大霉素C1a濃度為0～20u/mL時，慶大霉素C1a濃度與在波長為248nm時的吸光度有較高的線性關系。慶大霉素C1a的含量越高時，上清液的吸光度越小。線性方程式如式(1)所示，其中C為慶大霉素C1a的濃度u/mL，A為與磷鎢酸鈉反應后上清液吸光度，相關系數為0.9978。在波長為248nm時，通過測定反應上清液的吸光度，可以計算慶大霉素C1a的濃度。

2.1.5 高效液相色譜法與紫外分光光度法的比較

通過高效液相色譜法與紫外分光光度法分別測定發酵液中慶大霉素C1a的含量。兩種不同檢測方法的實驗結果如表2所示，最大相對誤差為3.98%。兩種不同的檢測方法具有一致性。紫外分光光度法具有較高的準確性，檢測速度快，可以應用于高通量篩選和誘變菌株的穩定性實驗。

2.2 菌株的不同誘變方式

2.2.1 ARTP誘變

使用常溫室壓等離子體儀器對絳紅小單孢菌進行誘變，在其等離子發射源與單孢子懸浮液的距離，氣體流速，輸出功率等參數一定的條件下，通過改變誘變時間，進行誘變實驗。誘變使用的工作氣體為高純氮(99.99%)，產生的等離子體溫度控制在25～35℃之間。通過計算菌體致死率，確定誘變時間。

實驗結果如圖4所示：隨著誘變時間的增加，孢子致死率增加，90s之前ARTP對孢子的誘變效果明顯。在120s時，致死率高達95%，180s后孢子致死率達到100%，選擇誘變時間為120s。

2.2.2 微波誘變

表2 高效液相色譜法和分光光度法測定發酵液中慶大霉素C1a含量的比較Tab. 2 Comparison of the gentamicin C1a contents in the broth determined by HPLC and spectrophotometry

在一定功率條件下，通過改變誘變時間，對單孢子懸浮液進行微波誘變，獲得高產誘變單菌落。通過計算誘變致死率，確定微波誘變時間。

圖4 ARTP誘變孢子致死率Fig.4 Lethality rate of the spores by ARTP

微波誘變實驗結果如圖5所示，隨著誘變時間增加，致死率升高，在150s之后致死率接近于100%。當誘變致死率達到90%時，微波誘變時間為135s。

2.2.3 氯化鋰誘變

使用20%氯化鋰誘變試劑與慶大霉素C1a單孢子懸浮液作用，隨著作用時間的增加，突變率增大。如圖6所示，當誘變時間為20min后，菌體致死率只有10%，遠遠小于ARTP和微波誘變方式的致死率。說明通過氯化鋰單一誘變方式誘變慶大霉素C1a菌種，致死率低，產生高產菌株的概率小。可以采取ARTP＋LiCl的復合誘變方式，對菌株進行誘變。

2.2.4 復合誘變

通過ARTP與LiCl復合誘變的方式，對慶大霉素C1a單孢子懸浮液進行誘變。通過計算致死率，確定復合誘變時間。如圖7所示，樣品菌種致死率隨著誘變時間的增加而提高，當誘變時間為120s時，致死率高達 98%，150s時，致死率為100%。

圖5 微波誘變孢子致死率Fig.5 Lethality rate of the spores by microwave

誘變時間的確定：當致死率達到90%時，ARTP誘變時間在90s到120s之間。復合誘變過程中加入化學試劑LiCl，可以提高菌體致死率，在90s之前高致死率的現象明顯，確定誘變時間為110s。

圖6 氯化鋰誘變孢子致死率Fig.6 Lethality rate of the spores by LiCl

圖7 ARTP和LiCl復合誘變孢子致死率Fig.7 Lethality rate of the spores by the combination of ARTP and LiCl

2.3 誘變菌株高通量篩選

2.3.1 初篩

通過快速檢測的方法測定發酵液效價，標記高產菌株。通過不同誘變方式獲得2336株誘變菌株，經過24孔板培養進行初步篩選，測定結果如圖8所示。其中含量高于對照組誘變菌株共計475株，效價高于對照組10%的高產菌株有221株，其中最高效價為925u/mL，該高產菌株是通過LiCl和ARTP復合誘變獲得，多數誘變菌株發酵的效價低于對照組(625.7u/mL)。

2.3.2 復篩

對初篩高于對照組效價10%的誘變菌株進行編號。其中編號為A101-A140和A201-A250是ARTP誘變方式的高產菌株，共計90株；W101-W130和W201-W228為微波誘變方式的高產菌株，共計58株；L1-L8為LiCl誘變方式的高產菌株，共計8株；AL101-AL120、AL201-A220和AL301-AL325為ARTP+LiCl復合誘變方式的高產菌株，共計65株。對初篩獲得的221株高產菌株進行搖瓶復篩，結果如圖9所示，得到高于對照組效價10%以上的突變株10株。其中復篩最高效價為950u/mL，編號為AL324。

2.3.3 慶大霉素C1a初篩、復篩實驗數據匯總

圖8 4種不同誘變方式的24孔板初篩結果Fig.8 The results of 4 different mutation methods with 24 MTPs in preliminary screening process

通過上述4種不同誘變方式，共計獲得2336株誘變菌株，如表3所示，其中ARTP誘變方式為841株，微波誘變方式為623株，LiCl誘變方式為452株，ARTP和LiCl復合誘變420株。正突變率分別為23%、20%、4%和33%，高產菌分別為193株、125株、18株和139株，共計475株。含量高于對照組含量10%的菌株為221株。其中LiCl誘變方式致死率最低，致死率僅為10%。實驗結果表明，在慶大霉素C1a菌種誘變中，LiCl只能作為輔助誘變劑使用且正突變最低。不同誘變方式的正突變株的最高效價分別為821、793、732和925u/mL，通過ARTP和LiCl復合誘變方式獲得的突變菌效價最高，與對照相比產量提高48%。采用復合誘變(ARTP+LiCl)的方式誘變菌株，正突變率較高。王風芹等[19]通過ARTP和亞硝基胍對兼性厭氧產丁醇芽孢桿菌(Bacillussp.)C2菌株進行復合誘變，獲得了高產菌株。

圖9 4種不同誘變方式的搖瓶復篩結果Fig.9 The results of 4 different mutation methods with shake flask in rescreening process

表3 不同誘變方式的初篩數據Tab. 3 The data summary of different mutation methods in preliminary screening process

通過搖瓶復篩篩選出10株效價高于對照組10%效價的誘變菌株。其中ARTP誘變方式為2株，微波誘變方式為2株，LiCl誘變方式為1株，ARTP+LiCl復合誘變方式為5株。通過搖瓶培養進行復篩實驗，在10株高產誘變菌株中，ARTP+LiCl復合誘變方式獲得的菌株最高效價950u/mL，編號為AL324，比出發菌株提高了52%，該誘變方式可以較大概率獲得高產菌株。這10株誘變菌株編號分別為A114、A213、W112、W127、L7、AL109、AL120、AL205、AL217和AL324。

2.4 高產菌株穩定性驗證實驗

將復篩得到的10株高產菌株進行穩定性驗證實驗。將種子培養液按照10%的接種量加入發酵搖瓶中進行連續5代的培養實驗，驗證菌株的穩定性。通過紫外分光光度法快速測定發酵液效價，結果如圖10所示：AL324、AL120、AL205和AL217在培養5代過程中，產物效價比較穩定，可以作為高產菌株進行后續相關研究。A114、A213、W112、W127、L7和AL109在培養2～3代之后，產物效價有大幅度的減少，其中A114、A213、W112、AL109效價與對照組效價(600u/mL)接近，而W127、L7低于對照組效價，這可能是由于在連續培養過程中菌種產生回復突變造成的[20]。

2.5 高產菌株5L發酵罐驗證

由搖瓶復篩的結果可知，AL324菌株的發酵單位最高，經過5次傳代穩定性考察，產物濃度基本保持在900u/mL以上。而AL120、AL205、A217經過5次傳代雖然發酵效價保持在800u/mL，但是明顯低于AL324高產菌株。鑒于此，在5L發酵罐上進行驗證實驗采用出發菌株作為對照組(control)，AL324作為實驗組，考察高產菌株代謝性能變化。

圖11為高產菌株與出發菌株過程參數對比曲線圖，分別對比了在5L發酵罐培養過程中的菌濃、殘糖、OUR、溶氧和慶大霉素C1a的發酵單位。由圖11A可知，出發菌株與高產菌株在發酵過程中菌濃并沒有明顯差異；圖11B中可知，高產菌株殘糖下降速率明顯高于出發菌株，而在過程曲線圖11C中也明顯看到高產菌株耗氧能力明顯強于出發菌株，在40h前高產菌株的OUR明顯高于出發菌株；從圖11E中可以看出C1a含量AL324菌株明顯高于出發菌株，發酵96h后AL324效價能達到1193u/mL，比對照組效價提高了81.3%。綜合各曲線圖分析表明，高產菌株AL324代謝活性要高于出發菌株。

3 結論

圖10 高產穩定性菌株驗證實驗Fig.10 The genetic stability verification with high yield GM C1a mutants

為了得到高產的慶大霉素C1a生產菌株，本論文建立了慶大霉素C1a的快速檢測方法，在此基礎上采用ARTP等誘變方法和高通量篩選技術獲得了高產穩定的菌株。

圖11 高產菌株AL324與出發菌株過程參數對比圖Fig.11 The comparison of the process parameter between the high yield mutant of AL324 and the parent strain

(1)建立了紫外分光光度法測定慶大霉素C1a含量的快速檢測方法。磷鎢酸鈉在248nm紫外波長條件下有特征吸收峰，磷鎢酸鈉與慶大霉素C1a能發生反應生成白色沉淀物質，通過測定反應上清液的吸光值，可以計算慶大霉素C1a的含量。結果表明，反應上清液吸光值與慶大霉素C1a效價具有線性關系，相關系數為0.9978。與高效液相色譜法對比，該方法的最大相對誤差為3.98%，說明本文建立的慶大霉素C1a快速檢測方法的有效性。

(2)考察了慶大霉素C1a菌株的不同誘變方法(ARTP、微波、LiCl和ARTP+LiCl)，并通過高通量篩選獲得了高產穩定的菌株。通過對2336株菌株的初篩，獲得了221株產量提高10%以上的菌種，通過搖瓶復篩獲得了10株菌株，其中ARTP+LiCl復合誘變產生的AL324菌株搖瓶效價提高了52%，復合誘變的正突變率較高。然后進行穩定性傳代實驗，獲得了4株高產穩定性菌株。在5L發酵罐驗證實驗中，AL324菌株效價比出發菌株提高了81.3%。