柱后衍生化-HPLC法測定硫酸卡那霉素注射液及滴眼液的含量

張楊慧 蔣孟虹 秦峰 劉浩,*

(1 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203；2 上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

卡那霉素(kanamycin)屬于2-脫氧鏈酶胺雙取代衍生物類的氨基糖苷類抗生素，由卡那霉素鏈霉菌(Streptomyces kanamyceticus)所產(chǎn)生，具有廣譜抗菌作用[1](主成分卡那霉素A及其主要雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示)，尤其對革蘭陰性菌及青霉素、鏈霉素、紅霉素等產(chǎn)生耐藥性的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣桿菌、肺炎桿菌和痢疾桿菌有很強(qiáng)的抗菌作用。Umezawa[2]于1957年發(fā)現(xiàn)卡拉霉素，1958年由日本明治制果藥業(yè)株式會社首先開發(fā)生產(chǎn)，國內(nèi)于1965年從云南西雙版納土壤中分離得到卡那霉素鏈霉菌，并研究試制成功國產(chǎn)的卡那霉素。

卡那霉素缺乏特征的紫外吸收[3]，中國藥典2015年版二部規(guī)定采用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)法測定硫酸卡那霉素注射液和滴眼液的含量[4]。ELSD具有通用性強(qiáng)、價格低廉、維護(hù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于ELSD法的重現(xiàn)性較差，靈敏度較低，且流動相中所含的多氟羧酸類離子對試劑酸性較強(qiáng)，影響色譜柱填料的穩(wěn)定性，不利于長期應(yīng)用。美國藥典第40版使用HPLC-電化學(xué)檢測的方法進(jìn)行含量測定[5]。雖然電化學(xué)檢測方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但儀器昂貴，對操作人員的技術(shù)水平要求較高，較難作為常規(guī)檢測方法使用。

柱后衍生化技術(shù)是一種常用的在線處理技術(shù)，具有不改變被分離組分的色譜行為、在流動相試劑的選擇上限制較小、可以實(shí)現(xiàn)自動化在線衍生、具有良好的重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，已在硫酸異帕米星注射液、妥布霉素滴眼液等氨基糖苷類抗生素的含量測定中有應(yīng)用[6-7]。本文參考文獻(xiàn)[6-7]建立的高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測法靈敏度高，操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為硫酸卡那霉素注射液及滴眼液含量測定的方法。

1 儀器與材料

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀，熒光檢測器，Pickering PCX 5200柱后衍生化系統(tǒng)。

庚烷磺酸鈉(色譜純)由東京化成工業(yè)株式會社提供；乙腈(色譜純)由Merck公司提供；冰醋酸、無水硫酸鈉、硼酸、氫氧化鈉和2-巰基乙醇(分析純)由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；鄰苯二甲醛(色譜純)由北京百靈威科技有限公司提供；水為高純水。

硫酸卡那霉素對照品(批號：130556-201502，中國食品藥品檢定研究院)；卡那霉素B對照品(批號：130548-200501，中國食品藥品檢定研究院)(發(fā)酵副產(chǎn)物)；6-O(3-氨基-3-脫氧-α-d-葡吡喃糖基)脫氧鏈霉胺(批號：7-APD-119-1，Toronto Research Chemicals)(降解產(chǎn)物)；硫酸卡那霉素注射液[批號：1612152，A公司；批號：1701170121，B公司；批號：1703021，C公司；批號：1701191，D公司；批號：151027，E公司]；硫酸卡那霉素滴眼液(批號：170203，170202，F(xiàn)公司)。

2 方法

2.1 色譜分離條件

圖1 卡那霉素A及其主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of kanamycin A and its chief related compounds

色譜柱Zorbax Eclipse Plus C18(4.6mm×100mm,3.5μm)；流動相：pH3.4的緩沖液(取庚烷磺酸鈉一水合物4.35g和無水硫酸鈉16g，加水溶解并稀釋至1000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.4±0.1)-甲醇(74:26)；流速：1mL/min；柱溫35℃；樣品室溫度4℃；進(jìn)樣體積：5μL。

2.2 衍生化條件

衍生化試劑[取鄰苯二醛0.8g、甲醇300mL、2-硫基乙醇2mL和硼酸鹽緩沖液(稱取72.0g硼酸和43.0g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至4000mL，用1mol/L硼酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10.4±0.1)700mL，混勻，用0.45μm濾膜過濾]的流速為0.3mL/min；衍生化反應(yīng)溫度：45℃；熒光檢測器激發(fā)波長：340nm，發(fā)射波長：455nm。

2.3 溶液的配制

系統(tǒng)適用性溶液：取卡那霉素對照品約10mg，置于50mL量瓶中，加2mol/L鹽酸溶液5mL，振搖使混合均勻，水浴加熱30min，使卡那霉素A部分降解產(chǎn)生雜質(zhì)3和雜質(zhì)4，用2mol/L氫氧化鈉溶液5mL中和，加卡那霉素對照品25mg和卡那霉素B對照品5mg，振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取系統(tǒng)適用性溶液5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，卡那霉素A與卡那霉素B之間能完全分離(分離度大于7.0)，主峰與前相鄰雜質(zhì)峰也有效分離(分離度大于2.0)(圖2)。

供試品溶液：精密量取硫酸卡那霉素注射液適量，加水定量稀釋制成約含卡那霉素0.5mg/mL的溶液。精密量取硫酸卡那霉素滴眼液適量，加水定量稀釋制成約含卡那霉素0.5mg/mL的溶液。

對照品溶液：精密稱取硫酸卡那霉素對照品適量，加水溶解并定量稀釋制成約含卡那霉素0.5mg/mL的溶液。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液(a)、注射液空白輔料溶液(b)和滴眼液空白輔料溶液(c)典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms for system suitability solution (a),injection solution of blank (b) and eye drops solution of blank (c)

3 方法學(xué)驗證

3.1 專屬性

分別取硫酸卡那霉素注射液及滴眼液空白輔料按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。色譜圖如圖2所示。結(jié)果表明流動相及空白輔料均對卡那霉素主峰及雜質(zhì)峰無干擾，表明方法的專屬性良好。

精密量取硫酸卡那霉素注射液適量，加水定量稀釋制成約含卡那霉素5mg/mL的溶液，作為硫酸卡那霉素注射液樣品儲備液；硫酸卡那霉素滴眼液原液即為其樣品儲備液；分別取樣品儲備液1mL進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、光照、氧化破壞，并用純水稀釋制成約含卡那霉素0.5mg/mL的溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。色譜圖如圖3所示。主峰與降解雜質(zhì)峰之間均分離良好，新建方法的專屬性良好。

3.2 重復(fù)性

精密量取同一批號的硫酸卡那霉素注射液6份，按“2.3”項下方法配制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定其含量，按外標(biāo)法以峰面積計算，平均含量為102.4%，RSD=0.75%(n=6)；同法對硫酸卡那霉素滴眼液的含量測定方法進(jìn)行重復(fù)性考察，平均含量為104.9%，RSD=0.66%(n=6)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3.3 回收率

精密稱取硫酸卡那霉素對照品適量(約相當(dāng)于卡那霉素20、25和30mg)，各3份，分別置于50mL量瓶中，并按100%比例加入輔料，加水溶解，作為80%、100%和120%的注射液供試溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定含量，3個濃度水平下平均回收率分別為100.1%、99.8%和98.9%，RSD=0.63%(n=9)；同法對硫酸卡那霉素滴眼液的含量測定方法進(jìn)行回收率考察，3個濃度水平下平均回收率分別為99.8%、98.9%和99.3%，RSD=0.66%(n=9)，結(jié)果表明該方法回收率良好。

3.4 線性與范圍

精密稱定對照品適量置于25mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液適量，制成系列濃度分別為0.0973、0.973、9.73、97.3、243.3、486.5和583.8μg/mL的對照品溶液。按“2.1”項下的色譜條件測定，以卡那霉素A峰面積A對濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=11.99C+15.73，r=0.9999。結(jié)果表明，卡那霉素A在0.0973～583.8μg/mL的范圍內(nèi)與卡那霉素A峰面積呈良好線性。

圖3 硫酸卡那霉素注射液(A～E)和滴眼液(F～J)專屬性試驗色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms for specificity test of kanamycin sulfate injection and eye drops

3.5 檢測限與定量限

以信噪比S/N=3計，卡那霉素A的檢測限為0.12ng；以信噪比S/N=10計，卡那霉素A的定量限為0.39ng(以進(jìn)樣5μL計)。

3.6 穩(wěn)定性

取供試品溶液，分別在0、6和18h進(jìn)樣分析考察溶液的穩(wěn)定性，按外標(biāo)法以峰面積計算，硫酸卡那霉素注射液平均含量為101.3%，RSD為1.42%(n=3)，滴眼液平均含量為106.4%，RSD為2.26%(n=3)，結(jié)果表明溶液在18h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 耐用性

分別考察了供試品溶液在Zorbax Eclipse plus C18(10cm×0.46cm, 3.5μm, 1.0mL/min)、COSMOSIL C18(25cm×0.46cm, 5μm, 1.5mL/min)和Tskgel ODS-100S(25cm×0.46cm, 5μm, 1.5mL/min)3種不同品牌填料的色譜柱上的分離情況，結(jié)果各雜質(zhì)峰均能和卡那霉素主峰得到有效分離，本方法的耐用性較好。

3.8 樣品測定

按“2.3”項下方法分別制備供試品溶液及對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣，依照外標(biāo)法計算含量，與2015版中國藥典二部[8]項下方法對比，結(jié)果見表1。結(jié)果表明本文所建立的高效液相-柱后衍生化-熒光檢測法測得的含量與HPLC-ELSD法(藥典方法)測得的含量基本一致。

表1 LC-柱后衍生化法與LC-ELSD法測定硫酸卡那霉素注射液及滴眼液含量結(jié)果的對比Tab. 1 Comparative study on the results of contents obtained from post column derivatization and ELSD in kanamycin sulfate injection and eye drops

4 新建立方法和中國藥典方法的比較

按中國藥典方法試驗[4]，以信噪比S/N=3計，硫酸卡那霉素檢測限約為22.9ng，比柱后衍生化-HPLC法低近200倍。柱后衍生化-HPLC法較HPLC-ELSD法靈敏度高。

按中國藥典方法試驗[4]發(fā)現(xiàn)，硫酸卡那霉素中有3個雜質(zhì)會同時洗脫，如圖4所示，HPLC-ELSD系統(tǒng)分離所得編號為2的雜質(zhì)實(shí)為HPLC-柱后衍生化系統(tǒng)中3個雜質(zhì)的混合物。柱后衍生化-HPLC法較HPLCELSD法分離能力高。

5 討論

5.1 色譜條件的優(yōu)化

由于硫酸卡那霉素極性較強(qiáng)，在反相色譜條件下保留較弱，本研究在流動相中加入離子對試劑，從而使被測組分在色譜柱上有適當(dāng)?shù)谋Ａ簟？疾炝思和榛撬徕c，庚烷磺酸鈉，辛烷磺酸鈉3種離子對試劑。結(jié)果顯示，隨著烷基鏈的延長，卡那霉素及其有關(guān)物質(zhì)保留均增強(qiáng)，考慮到分析時間的合理性，選擇庚烷磺酸鈉作為離子對試劑。

圖4 HPLC-ELSD系統(tǒng)(a)與HPLC-柱后衍生化-熒光檢測系統(tǒng)(b)各色譜峰保留行為典型色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of impurities in ELSD (a) and post column derivization systems (b)

本試驗考察了30、35和40℃不同色譜柱溫對色譜分離的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，色譜柱溫越低，容量因子越大，色譜峰保留時間越長，綜合考慮保留時間，對稱因子，分離度等因素，選擇色譜柱溫度為35℃。

本試驗考察了流動相中有機(jī)改性劑的種類對定量分析的影響。選擇了甲醇和乙腈兩種有機(jī)改性劑，結(jié)果顯示，雖然乙腈的洗脫能力強(qiáng)于甲醇，但以乙腈為有機(jī)溶劑的色譜系統(tǒng)，其主峰拖尾嚴(yán)重，不利于定量分析。考察了不同比例的甲醇對色譜行為的影響，在主峰與相鄰雜質(zhì)峰得到有效分離的前提下，甲醇比例越高，主峰保留越弱，綜合考慮對稱因子，理論塔板數(shù)，保留時間等因素，確定緩沖液與甲醇比例為74:26。

5.2 柱后衍生化條件的優(yōu)化

在柱后衍生化試劑的選用時要考慮到衍生化產(chǎn)物的溶解度，衍生化試劑與流動相及制劑輔料可能發(fā)生的副反應(yīng)等因素。常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)[6-7]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[8]、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)[9]等。本研究中采用的柱后衍生化試劑為含有2-巰基乙醇和鄰苯二甲醛的溶液，其反應(yīng)機(jī)制主要是在巰基乙醇的存在下，伯氨基與鄰苯二甲醛快速反應(yīng)生成強(qiáng)熒光性吲哚取代衍生物，被熒光檢測器檢測。由于硫酸卡那霉素注射液和硫酸卡那霉素滴眼液中所含有的輔料[抗氧劑(亞硫酸氫鈉)，等滲調(diào)節(jié)劑(氯化鈉)，抑菌劑(羥苯乙酯)，緩沖劑(硼砂-硼酸體系)，絡(luò)合劑(依地酸二鈉)等]均不含有伯胺類物質(zhì)，所以輔料對主藥的測定不產(chǎn)生干擾。

本試驗考察了0.3、0.5和0.7mL/min衍生化試液的流速對衍生化情況的影響。試驗中發(fā)現(xiàn)衍生化試液的流速對色譜峰響應(yīng)的影響較小，且流速越快，柱后壓力越大，考慮到衍生化試液的使用量及柱后壓力的影響，選擇柱后衍生化試液流速為0.3mL/min。

6 結(jié)論

本文建立的高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測法操作簡便、抗干擾性強(qiáng)、柱效高、分離能力強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，可彌補(bǔ)HPLC-ELSD法靈敏度較低，分離能力較差的缺點(diǎn)，可作為硫酸卡那霉素注射液和滴眼液的含量測定方法，有效控制硫酸卡那霉素的質(zhì)量。