HPLC-MS/MS法測定人血漿中伏立康唑濃度的不確定度評價

于思源 馮志平

(江門市中心醫(yī)院藥學部，中山大學附屬江門醫(yī)院，江門 529000)

不確定度的定義為表征合理地賦予被測量之值的分散性，廣義而言，意為對測量結(jié)果正確性的可疑程度。不確定度的評定方法通常有A和B兩種，A類評定是由一系列重復觀測值計算得到，而B類評定是根據(jù)有關信息(假定的概率密度函數(shù))來評定[1]。伏立康唑作為新一代三唑類廣譜抗真菌藥廣泛用于治療血液病、移植或免疫缺陷患者的侵襲性真菌感染[3-4]。由于伏立康唑主要通過細胞色素P450同工酶2C19酶(CYP2C19)代謝，該酶活性存在顯著的個體和種族差異，表現(xiàn)為遺傳多態(tài)性[5-7]；不同人群間病理生理差異等也可能使伏立康唑體內(nèi)藥動學特征產(chǎn)生較大差異，從而導致個體間血藥濃度偏差較大，濃度過高易發(fā)生不良反應(ADR)，而濃度過低則導致臨床治療失敗。研究表明伏立康唑的血藥濃度與臨床療效、ADR的關系密切[8]。因此濃度檢測的準確性是準確調(diào)整用藥的前提。目前為止，伏立康唑液質(zhì)聯(lián)用測定方法的不確定度尚未見文獻報道，為了評估測定方法的準確性，改進實驗步驟，提高檢測質(zhì)量，本文根據(jù)相關的規(guī)范和指南[1-2]并參考相關文獻[9-12]，對HPLC-MS/MS測定人血漿中伏立康唑濃度的不確定度進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀、6460C三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Aglient科技公司；高速冷凍離心機，德國Sigma公司；XSE205DU型電子分析天平，瑞士Mettler公司；GenPure，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試藥

伏立康唑?qū)φ掌?批號：81607441，質(zhì)量分數(shù)：99.50%，珠海麗珠制藥廠)；氯雷他定對照品(內(nèi)標，批號：DC-0201-1503002，質(zhì)量分數(shù)：99.80%，浙江東亞藥業(yè)股份有限公司)；乙腈和甲醇均為色譜純，Thermo Fisher Scientific公司；甲酸為色譜純，Dikma Technologies公司；甲酸銨為色譜純，Sigma-Aldrich公司。方法學研究所用健康人空白血漿，由江門市中心醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(50mm×4.6mm, 1.8μm)；流動相比例為乙腈：含0.1%甲酸的10mmol/L甲酸銨水溶液(85:15)，等度洗脫2.5min，流速為0.4mL/min，柱溫為40℃，進樣量為1μL。

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子MRM模式，質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細管電壓4000V，干燥氣流速11L/min，霧化氣壓力15psi，干燥氣溫度300℃，伏立康唑：碎裂電壓120V，碰撞能量15V，離子對：m/z350.0→280.9；氯雷他定：碎裂電壓140V，碰撞能量20V，離子對：m/z383.0→337.0。

2.2 溶液的制備

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?0.17mg，置于5mL容量瓶中，50%甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為2.02mg/mL的伏立康唑儲備液，置于4℃冰箱中保存，備用。臨用前取伏立康唑儲備液適量，用50%甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、2、5、20、50、100和200μg/mL的系列標準溶液，置于5mL容量瓶中；另取伏立康唑儲備液適量，用50%甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、30和160μg/mL的質(zhì)控溶液置于5mL容量瓶中。

精密稱取內(nèi)標對照品11.50mg，置于5mL容量瓶中，50%甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為2.295mg/mL的內(nèi)標儲備液，置于4℃冰箱中保存，備用。臨用前將內(nèi)標儲備液用50%甲醇稀釋成濃度為3μg/mL的內(nèi)標溶液，置于5mL容量瓶中。

2.3 標準曲線樣品和質(zhì)控樣品的配置、處理

取95μL空白人血漿，加入伏立康唑系列標準溶液和質(zhì)控溶液各5μL，配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.1、0.25、1.0、2.5、5和10μg/mL的標準曲線血漿樣品及0.025、1.5和8.0μg/mL的質(zhì)控樣品。

精密吸取含藥血漿樣品100μL，加入3μg/mL內(nèi)標溶液5μL，渦旋1min；再加入純乙腈600μL沉淀蛋白，渦旋振蕩3min，15000r/min離心5min，取其上層清液100μL轉(zhuǎn)移至進樣瓶內(nèi)，進樣1μL分析。

2.4 數(shù)學模型的建立

以VOR濃度為x軸，以VOR與內(nèi)標信號的面積比為y軸，用最小二乘法進行線性回歸，線性回歸方程：y=ax+b，其中：x為VOR濃度，y為VOR與內(nèi)標的峰面積比，a為回歸方程的斜率，b為截距。

2.5 測量不確定度來源分析

分析整個實驗流程，測量不確定度的來源主要有：溫度、重復性、對照品稱量、工作液配制、樣品制備、基質(zhì)效應、樣品提取、標準曲線擬合、儀器允差、對照品純度和樣品不均勻性等因素(圖1)。

2.6 溫度對測定的影響

實驗室溫度控制在(20±2)℃，標準曲線和待測樣品均在相同溫度下制備和測定，因此溫度引入的不確定度可忽略。

2.7 測量不確定度的評定

2.7.1 重復性(用A類評定程序)

重復性引入的不確定度用質(zhì)控樣品重復測定值評估，低、中、高3個濃度(0.025、1.5和8.0μg/mL)的質(zhì)控樣品各3組(m=3)，每組平行測量5次(n=5)，結(jié)果見表1。用貝塞爾公式計算合并樣品偏差：

圖1 不確定度來源的因果分析圖Fig.1 Causal analysis chart of uncertainty sources

表1 樣品重復測定數(shù)據(jù)Tab. 1 Repeatability of sample determination

其中：i為組數(shù)，j為每組平行測定次數(shù)(i=3,j=5)。每組5個測定值的平均值的標準偏差為：

2.7.2 對照品稱量引入的不確定度(用B類評定程序)

對照品稱量引起的不確定度可表示為：

其中，天平的重復性誤差u(m)在重復性實驗中已經(jīng)得到評定，不再重復計算。由自動調(diào)零引起的誤差u(△0)和天平的非線性誤差u(△)按均勻分布，包含因子k=3，隨機變量半寬a=0.5e，依據(jù)計量檢定證書，天平檢定分度值e=0.01mg，則標準測量不確定度為：

減重對照品稱量時自動調(diào)零作為一次扣皮，則a0=a，u(△0)=a0/k=u(△)=0.0029。天平的標準測量不確定度為：

VOR對照品稱量的質(zhì)量為10.17mg，則VOR對照品稱量相對標準測量不確定度為：

內(nèi)標(IS)對照品稱量的質(zhì)量為11.50mg，則內(nèi)標對照品稱量相對標準測量不確定度為：

稱量引起的相對標準測量不確定度為：

2.7.3 樣品配制引入的測量不確定度(用B類評定程序)

(1)容量瓶引入的測量不確定度：用于儲備液配制的A 級容量瓶(F)規(guī)格為5mL，其最大允許誤差為±0.020mL。由于溫度對定容的影響非常小，忽略不計。按均勻分布，其相對標準不確定度為：ur=a/(kx)，則：

(2)移液器引入的測量不確定度：本次所用移液器為Eppendorf可調(diào)量程移液器，其中所用的Eppendorf移液器量程為：0.5～10μL(P1)，10～100μL(P2)、100～1000μL(P3)和0.5～5μL(P4)。參照Eppendorf說明書，P1在5μL時最大允差為±1.5%；P2在100μL時最大允差為±0.8%；P3在500和1000μL時最大允差分別為±1%、±0.6%；P4在2～2.5mL時最大允差為±1.2%。按均勻分布，包含因子，則移液器的相對標準測量不確定度：ur(P1-5)=0.0061，ur(P2-100)=0.0033，ur(P3-500)=0.0033，ur(P3-1000)=0.0024，ur(P4-2.5)=0.0049。

(3)標準溶液和質(zhì)控溶液配制引入的測量不確定度：儲備液配制時的相對標準不確定度已經(jīng)在容量瓶定容中引入，因此可以忽略；在使用儲備液配制標準溶液(STD)時，共使用5mL容量瓶8次；100～1000μL(P3)移液器2次，其中使用500μL 1次，1000μL 1次；0.5～5mL(P4)移液器3次，其中使用2～2.5mL 6次；在使用儲備液配制質(zhì)控溶液(QC)時共使用5mL容量瓶4次，低質(zhì)控2次，中質(zhì)控1次，高質(zhì)控1次；100～1000μL(P3)移液器4次，其中高質(zhì)控使用100～500μL 1次，中質(zhì)控使用500～1000μL 1次，低質(zhì)控使用500～1000μL 2次。查閱相關文獻[13]，標稱容量為介于給定的兩個容量點之間的值，那么它的最大允差是以任一兩個容量之間較大容量為標準的，因此100～500μL的最大允差按500μL計算，500～1000μL的最大允差按1000μL計算，2mL的最大允差按2.5mL計算。內(nèi)標配制不影響測定，則對照品溶液配制引入的相對標準測量不確定度為：

(4)含藥標準樣品和質(zhì)控樣品配制引入的不確定度：配制含藥標準樣品(S)和質(zhì)控樣品(QC)時，使用10～100μL移液器吸取95μL空白血漿，后使用0.5～10μL移液器吸取系列標準溶液或質(zhì)控溶液、內(nèi)標溶液各5μL，加入到空白血漿中，后使用100～1000μL移液器加入600μL純乙腈進行樣品提取。因此，所用移液器的型號和次數(shù)均為：0.5～10μL(P1)2次，10～10μL(P2)1次，100～100μL(P3)1次，同上“2.7.3”項“(3)”中最大允差計算原則，則配制含藥標準樣品和質(zhì)控樣品的相對標準測量不確定度為：

則樣品配制過程中引入的相對不確定度為：

該段落第二句是論據(jù)句，它只是呈現(xiàn)了一個事實：歌手龐麥郎以一首《我的滑板鞋》驚醒了很多當代人。而通過分析，我們恍然大悟：清醒地與時代保持一段距離其實也是真實地表現(xiàn)時代的聲音，這樣的聲音恰恰贏得時代的共鳴。這樣的論據(jù)雖然只有一個，但很有說服力。很多考生錯誤地認為，論據(jù)越多越好，其實不然，精當?shù)恼摀?jù)常起到一以當十的效果。

2.7.4 基質(zhì)效應和蛋白沉淀過程引入的測量不確定度(用A類評定程序)

(1)基質(zhì)效應的影響：質(zhì)譜法中，基質(zhì)效應(ME)可影響最終的測定結(jié)果，其不確定度必須考慮。評估方法如下：分別用處理后基質(zhì)及空白溶劑配制低、高2個濃度(0.025和8.0μg/mL)質(zhì)控樣品，平行測定5次，計算方法：基質(zhì)效應=處理后基質(zhì)配制樣品的峰面積與內(nèi)標峰面積比值(A)/空白溶劑配制樣品的峰面積與內(nèi)標峰面積比值(B)，經(jīng)內(nèi)標校正后的低濃度和高濃度質(zhì)控血漿樣品的基質(zhì)效應因子分別為(90.68±2.94)%及(93.31±3.18)%，則基質(zhì)效應ur(5)引入的相對標準測量不確定度為：

(2)樣品提取過程的影響：

樣品提取過程(RE)同樣會影響測定結(jié)果，其引入的不確定度由樣品提取評估。評估方法如下：以未處理基質(zhì)和處理后基質(zhì)制備低、中、高3個濃度(0.025、1.5和8.0μg/mL)的質(zhì)控樣品，每個濃度平行配制3份，計算方法：樣品提取(%)=100%×血漿配制樣品蛋白沉淀后的峰面積與內(nèi)標峰面積比值(C)/處理后基質(zhì)配制樣品的峰面積與內(nèi)標峰面積比值(D)，經(jīng)內(nèi)標校正后的低、中、高濃度質(zhì)控血漿樣品的樣品提取分別為(104.73±10.62)%、(102.47±7.97)%、(94.94±3.67)%，當樣本量較小時，樣品提取ur(6)引入的相對標準測量不確定度使用極差法進行計算[1]，

即：

結(jié)果分別為：ur(RE,L)=6.07%，ur(RE,M)=4.76%，ur(RE,H)=2.31%。

2.7.5 儀器量化引入的測量不確定度(用B類評定程序)

質(zhì)譜儀為Agilent 6460C三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，液相為Agilent 1290 infinity，根據(jù)設備校準報告，進樣峰面積重復性為4.9%，按均勻分布，包含因子，儀器量化相對標準測量不確定度為：ur(7)=2.83%。

標準曲線包括8個濃度，用VOR峰面積與內(nèi)標峰面積的比值對VOR濃度進行標準曲線擬合，以1/x2作為權(quán)重(w)。標準曲線中VOR與內(nèi)標的峰面積比及3條標準曲線的斜率和截距見表2，用擬合的標準曲線反算出對照品血漿的VOR濃度見表3。

表2 VOR與內(nèi)標峰面積比及回歸曲線參數(shù)Tab. 2 Area ratio of VOR with the internal standard and parameters of the calibration curves

標準曲線有8個濃度點，n=8，對照品血漿每個濃度測定的次數(shù)為3次，m=3，N為測定標準血漿溶液的總次數(shù)，N=m×n=24；am為標準曲線的斜率；b為標準曲線截距；xi為第i個標準血漿溶液的濃度，x為8個標準血漿濃度的理論平均值，x=2.3783μg/mL；i為每組對照溶液的序數(shù)(i=1, 2, …,m)，j為測定血漿標準溶液的序數(shù)(j=1, 2 ,3, …,n)。

表3 用擬合曲線計算出每個對照品血漿VOR的濃度Tab. 3 Back-calculated concentrations of VOR in standard plasma samples

自相關方差為：

殘余標準差為：

測定低、中、高濃度質(zhì)控樣品各15次，P=15，計算得平均濃度：則標準曲線擬合的標準測量不確定度為：

其中，Sxx表示自相關方差，wi為權(quán)重。var(yobs)表示樣品觀測值方差，計算公式：

其中，S為殘余標準差。u(xL)=0.0082，u(xM)=0.0075，u(xH)=0.0117。則標準曲線擬合引入的相對標準測量不確定度為：

2.7.7 對照品純度和樣品不均勻性引入的不確定度

伏立康唑?qū)φ掌泛蛢?nèi)標氯雷他定的質(zhì)量分數(shù)均不是100%，限度標識可按1%計(假定符合均勻分布)，則相對不確定度為ur(9)=1%/=0.58%；由于樣品均為液態(tài)，使用前混合均勻，由樣品不均勻性引入的不確定度忽略不計。

2.8 標準測量不確定度的合成及擴展

2.8.1 標準測量不確定度的合成

依據(jù)不確定度傳播規(guī)律對各相對標準測量不確定度進行合成：

則VOR質(zhì)控樣品的合成標準測量不確定度分別為：

2.8.2 標準測量不確定度的擴展

采用簡易評定法，對應的置信概率P=95.45%(k=2)，則擴展不確定度分別為：

2.9 測定結(jié)果的表示

當置信概率P=95.45%(k=2)，血漿中VOR低、中、高濃度質(zhì)控的測定結(jié)果可以分別表示為(0.025±0.0018)、(1.5±0.2057)和(8±0.8723)μg/mL。

3 討論

本文通過HPLC-MS/MS法測定血漿中伏立康唑濃度的實驗流程，尋找不確定度的來源并計算，對各不確定度分量進行合成并擴展(圖2)。本試驗未考慮溫度引入的不確定度，原因是實驗室溫度控制在(20±2)℃，且標準曲線和待測樣品幾乎在同一時間配制，溫度變化很小。樣品在制備時均混合均勻，因此樣品不均勻性引入的不確定度可忽略不計。

首先，從計算結(jié)果可知，對照品稱量引入的不確定度很小，與文獻報道類似[9-10]幾乎可以忽略不計，這是因為對照品稱量所用分析天平為十萬分之一級，因此配備高精度的天平可顯著減小對照品稱量引入的誤差；高，中、低質(zhì)控濃度樣品提取引入的不確定度差別很大，尤其是低質(zhì)控的不確定度相對較大，筆者認為主要是由于向處理后的基質(zhì)中添加內(nèi)標和質(zhì)控工作液時未充分混勻或混勻效果不佳，導致測定結(jié)果的標準差相對較大。因此，筆者建議在向處理后的基質(zhì)中添加內(nèi)標或質(zhì)控工作液后，輕微渦旋5～10s，溶液擴散應更為均勻，人為操作誤差可能更小；標準曲線擬合對低濃度質(zhì)控溶液的影響最大，可能與標準曲線范圍相對較大，測定點的個數(shù)和重復測定次數(shù)相對較少密切相關；液質(zhì)聯(lián)用儀的進樣重復性引入的不確定度，筆者建議在正式進樣前使用當天一批中最低濃度樣品和中等濃度樣本，至少各進3針，可能會有效防止質(zhì)譜信號漂移，減少測量結(jié)果的不確定度。

圖2 不確定度分量的統(tǒng)計條形圖Fig.2 Statistical bar graph of uncertainty components

綜上所述，本文評定了LC-MS/MS法測定人血漿中VOR濃度的不確定度，在低濃度時主要由標準曲線擬合，樣品提取和重復性引入，在中濃度時主要由樣品提取和儀器允差引起，在高濃度時主要由儀器允差，重復性和樣品提取引入，另外，依照《中國藥典2015年版生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，本次研究在考察基質(zhì)效應時未將中質(zhì)控溶液納入，因此，基質(zhì)效應對中質(zhì)控溶液的影響并未評價。