頂空毛細管氣相色譜法同時測定磷酸特地唑胺原料藥中4種有機溶劑的殘留量

呂丹 唐克慧 王宇弛 張春然 王瑛瑛 張靜霞 王術蘭

(成都大學四川抗菌素工業研究所，成都 610052)

磷酸特地唑胺(tedizolid phosphate)，化學名為(R)-3-{4-[2-(2-甲基四唑-5-基)吡啶-5-基]-3-氟苯基}-5-羥甲基噁唑烷-2-酮磷酸酯，是一種噁唑烷酮類抗生素[1-2]。2014年上半年，磷酸特地唑胺獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準，用于治療由某些敏感革蘭陽性菌引起的急性細菌性皮膚及皮膚組織感染(ABSSSI)的第二款新型抗菌藥物[3]。其作為具有新型化學結構的抗菌藥物用于治療革蘭陽性菌感染有巨大的市場需求。和利奈唑胺相比，具有增加藥效和縮短治療持續時間的雙重優勢[4-5]。經查閱文獻發現，目前該品種國內外藥典均未收載。近兩年來，國內外關于磷酸特地唑胺的含量測定和有關物質檢測有少量報道[6-9]，而關于測定磷酸特地唑胺原料藥中有機溶劑殘留量在國內外均未見到文獻報道，磷酸特地唑胺在合成工藝中使用了有機溶劑甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和二氧六環等有機溶劑[8]。二氯甲烷屬于第一類溶劑，二氧六環和甲醇屬于第二類溶劑，乙酸乙酯屬于第三類溶劑，出于對人體安全的考慮，需要對這些殘留溶劑加以控制。本研究基于中國藥典2015年版(四部)“通則0861”[10]和人用藥品注冊技術要求國際協調會議(ICH)中有機溶劑殘留量指導原則[11]，建立了磷酸特地唑胺原料藥中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和二氧六環殘留量的頂空氣相色譜檢測方法，希望為控制磷酸特地唑胺原料藥的殘留有機溶劑提供一定的參考[12-16]。

1 材料

1.1 儀器

Aglient 7890A型全自動氣相色譜儀、Aglient G1888頂空全自動進樣器、FID(氫火焰離子化檢測器，美國Agilent公司)、ChemStation在線色譜工作站；Agilent DB-624色譜柱(30m×0.53mm, 3.0μm)，KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D型天平(賽多利斯公司)。

1.2 藥品與試劑

磷酸特地唑胺原料藥(四川大學華西藥學院自制，批號：170901、170902和170903)；甲醇對照品(色譜純，批號：A160800Z492)、二氯甲烷對照品(色譜純，批號：72009)、乙酸乙酯對照品(色譜純，批號：75924)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，批號：91D1511PM)均購自德國Merck公司，二氧六環對照品(分析純，批號：2016041301)購自成都市科龍化工試劑廠，純度均≥99.8%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Aglient DB-624毛細管柱(30m×0.53mm,3.0μm)為本方法色譜柱；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)；進樣口溫度設置為200℃；FID檢測器溫度設置為250℃；柱溫采取程序升溫方式：起始柱溫設置為50℃保持5min，然后以15℃/min升溫至220℃后再保持5min；載氣使用高純N2，其柱流速為3.0mL/min；分流比設置為5:1；進樣方式為頂空進樣；頂空進樣體積為1.0mL；頂空瓶裝樣量為10mL；頂空瓶溫度設定為100℃；頂空平衡時間設置30min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白溶液(稀釋劑)

精密量取DMF 1mL，置于10mL頂空瓶中密封保存備用。

2.2.2 混合對照品溶液

精密稱取甲醇150mg、二氯甲烷30mg、乙酸乙酯250mg、二氧六環對照品各19mg，分別用DMF稀釋至10mL，作為單個對照溶液，備用；分別精密量取2mL單個對照品溶液于50mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，再搖勻后作為混合對照品儲備液；精密量取2.5mL混合對照品儲備液于量瓶中，加DMF稀釋至10mL，再搖勻后作為混合對照品溶液。取1mL置于10mL頂空瓶中，加蓋密封保存備用。

2.2.3 供試品溶液

精密稱定本品適量，加DMF溶解并定容，超聲助溶5min使之溶解，搖勻，制成含50mg/mL的供試品溶液，備用。精密量取1mL供試品溶液于10mL頂空瓶中，加蓋密封即得，備用。

2.3 系統適用性試驗

分別精密量取“2.2.2”項下單一對照品溶液1.0mL，在“2.1”條件下進樣測定，對各待測組分在Aglient色譜工作站所得色譜圖中進行定位檢測。另精密量取“2.2”項下空白對照溶液、混合對照品溶液、供試品溶液，同法測定，記錄色譜圖樣報告，所得空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液氣相圖譜為圖1。由圖1可見，在本實驗的色譜條件下，各待測組分相互無干擾，均能達到良好的分離，峰形良好，分離度＞1.5，理論塔板數均大于50000；甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六環、DMF的保留時間分別為2.975、3.885、4.544、5.715和7.224min。由此可見，該方法系統適用性符合要求。

圖1 氣相色譜圖Fig.1 The GC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密量取混合對照品儲備液(“2.2.2”項下制得的備用溶液)0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10mL，分別置于量瓶中，加DMF稀釋至10mL作為系列標準曲線混合對照測試溶液，依次取上述溶液1.0mL于頂空瓶中，加蓋密封，再采用本實驗色譜條件(“2.1”項下)同法進樣測定分析，分別記錄各個系列的色譜峰面積。以各個對照品的質量濃度ρ(μg/mL)為橫坐標，以與之相對應的峰面積(A)為縱坐標在Excel辦公軟件中進行線性回歸分析，分別得到甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六環的標準曲線線性回歸方程及線性范圍，結果見表1。

表1 4種殘留溶劑的線性方程和線性范圍Tab. 1 Linear regresstion equations and their concentration range of four residual solvents

2.5 定量限與檢測限的測定

精密量取混合對照品溶液(“2.2.2”項下)，采用逐級稀釋法，采用本實驗設定的色譜條件(“2.1”項下)同法進行檢測，記錄S/N(信噪比)，當S/N約為10:1時計算出定量限(LOQ)；當S/N約為3:1時計算出檢測限(LOD)，檢測結果見表2。

表2 LOQ與LOD檢測結果Tab. 2 Determination results of LOQ and LOD

2.6 精密度試驗

秘密量取混合對照品溶液1mL于頂空瓶中，加蓋密封，采用本實驗色譜條件同法進行分析，連續重復進樣測定6次，計算甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六環峰面積的RSD分別為0.65%、1.12%、0.73%和1.36%(n＝6)。殘留有機溶劑組分的RSD均小于2%，說明本方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗

制備供試品溶液(批號：170901)6份，分別放置室溫下0、1、2、4、6和8h時后采用本實驗色譜條件同法進行檢測分析，記錄色譜峰面積。結果本品中二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六環均未檢出，只檢出甲醇，其峰面積的RSD為1.15%(n＝6)，表明本溶液在8h內(室溫)穩定。

2.8 重復性試驗

同一分析人員平行制備6份供試品溶液(按“2.2.3”項下方法)，精密稱取本品(批號：170901)約50mg，共6份，分別置于10mL頂空瓶中，在上述相同色譜條件下進行分析檢測，記錄峰面積并計算這6份供試品溶液中有機溶劑的殘留量。檢出本品中甲醇殘留量的平均值為0.01%，RSD為0.63%(n=6)，其他成分未檢出，說明本實驗采用的方法重復性較好。

2.9 回收率試驗

精密稱定已知的各組分含量的磷酸特地唑胺(批號：170901)50mg，分別置于10mL頂空瓶中，共9份。加入各溶劑限度的80%、100%和120%質量的待測組分的相應的單一對照品，各3份，在本實驗設定的條件下同法測定(“2.2.3”和“2.1”項下)，記錄峰面積并用外標法計算甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六環的加樣回收率。再分別統計平均回收率依次為104.83%、98.79%、102.65%和97.12%，RSD依次為0.92%、1.64%、0.70%和1.72%(n=9)，結果表明，本研究采用的檢測方法的準確度良好。

2.10 樣品中有機溶劑殘留量的測定

分別取3批磷酸特地唑胺原料藥(批號分別為170901、170902和170903)各50mg，采用本實驗方法(“2.2”和“2.1”項下)進樣分析，并用外標法計算3批磷酸特地唑胺原料藥中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六環的殘留量，結果見表3。

表3 磷酸特地唑胺中有機溶劑殘留量檢測結果(n=3, %)Tab. 3 The test results of residual organic solvents of tedizolid phosphate (n=3, %)

根據中國藥典2015年版四部規定，甲醇限度為0.3%，二氯甲烷限度為0.06%，乙酸乙酯限度為0.5%，二氧六環限度為0.038%。檢測結果顯示3批樣品中均只檢出甲醇殘留，殘留均未超過限度。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

磷酸特地唑胺原料藥的水溶性較差，若用水作溶劑某些殘留有機溶劑可能會被包埋在未溶解的固態磷酸特地唑胺樣品中，導致進樣濃度不精確，故不宜選擇水作為溶劑。而磷酸特地唑胺原料藥在DMF(N, N-二甲基甲酰胺)和DMAC(N, N-二甲基乙酰胺)中溶解性好，但DMF比DMAC價格更便宜，4種待測有機溶劑在DMF有較好的溶解性，DMF出峰在4種待測有機溶劑之后不會干擾測定結果，且溶解于DMF中各殘留溶劑均能達到良好的分離，故選擇DMF作為溶解樣品的溶劑及稀釋劑[17]。

3.2 色譜柱的選擇

本研究分別選用HP-5、DB-1、DB-4、DB-wax和DB-624毛細管柱進行實驗，結果顯示采用DB-624毛細管柱進行分離時，分離效果最好，峰形最尖銳且對稱，靈敏度較高，故本試驗選用DB-624毛細管柱為色譜柱。

3.3 頂空平衡溫度的考察

頂空平衡溫度越高，頂空瓶內的飽和蒸氣壓越高，揮發氣體的濃度越高，靈敏度就相應越高。但是溫度過高可能會損壞頂空進樣瓶導致瓶口漏氣，使得待測成分濃度不準確，以及某些物質可能會產生降解產物影響測定的結果[18]。當平衡時間為30min時，本課題組比較了頂空平衡溫度60、70、80、90、100、110和120℃下的待測溶劑的峰面積，發現色譜峰面積隨著平衡溫度的升高而升高，但在100℃以上的色譜峰面積增加不明顯，當溫度升至110℃時，有少量未知降解雜質出現，考慮到在100℃各待測有機溶劑都能檢出且有良好的響應，故本實驗的頂空平衡溫度設置為100℃。

3.4 頂空平衡時間的考察

頂空平衡的時間要能保證樣品溶液中的氣液兩相達到平衡，當頂空平衡溫度為100℃時，本課題組比較了頂空平衡時間5、10、20、30、40、50和60min時的色譜峰面積，在5～30min，色譜峰面積逐漸增大，30～60min時峰面積幾乎不再增加，可見在30min時各待測有機溶劑已在氣液兩相間達到平衡，考慮到平衡時間不宜過長，在30min條件下也無雜質干擾測定結果，故本試驗選擇30min作為頂空平衡時間。

4 結語

本研究首次通過頂空毛細管氣相色譜法測定磷酸特地唑胺原料藥中的4種殘留有機溶劑，并對其進行了方法學驗證。結果表明，在本實驗設定的色譜條件下，各殘留溶劑之間分離效果好，靈敏度高，在濃度范圍內線性良好，回收率符合規定。該頂空氣相色譜研究方法快速、簡便、經濟、靈敏，準確、精密度和重現性良好，適合磷酸特地唑胺原料藥中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和二氧六環等有機溶劑的殘留量的同時測定，可以為藥物分析工作者對磷酸特地唑胺原料藥中殘留溶劑的質量控制提供一定的參考。