以降解產物的量表征西羅莫司口服溶液質量的探討

趙敬丹 聞宏亮 秦峰 劉浩

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

西羅莫司(sirolimus)又稱雷帕霉素(rapamycin)，是1975年發現的親脂性大環內酯類免疫抑制劑[1]。1999年10月惠氏制藥研制的西羅莫司口服溶液在美國首次上市，2005年國內有3家企業獲批生產，主要適用于接受腎移植的患者，預防器官排斥。現行各國藥典均未收載西羅莫司及其口服溶液，執行標準均為國家食品藥品監督管理總局標準[2-4]。

西羅莫司口服溶液中的輔料主要有吐溫80及Phosal 50PG等。其中，Phosal 50PG是主要組成部分，其性狀為黏稠液體，是復合改性磷脂，主要包括磷脂酰膽堿、丙二醇、單甘油脂肪酸酯、乙醇、大豆脂肪酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯。經本試驗證實：吐溫80和Phosal 50PG在西羅莫司紫外吸收光譜范圍內均有吸收，這增加了采用紫外檢測器測定西羅莫司口服溶液中有關物質的難度。

由于輔料的干擾，現行標準分別采用質譜法或通過改變檢測波長控制其有關物質。其中，質譜法采用選擇性離子監測的方式控制開環降解物、異構體和同系物的量，本試驗發現：該方法重現性差，通用性差。而液相色譜法僅控制西羅莫司發酵工藝中產生的雜質—去甲基西羅莫司，不控制降解產物，并且存在明顯的輔料干擾現象，實驗結果重復性較差。

本文首先采用自建的西羅莫司有關物質分析方法[5]，但試驗結果顯示，輔料的色譜保留“貫穿”整個色譜分析過程。由于Phosal50PG具有類似蜂蜜一樣的黏稠度，在分析過程中不可避免會干擾測定。為了解決該問題，分別嘗試利用溶解性的差異沉淀輔料或固相萃取除去輔料的方法及正相色譜法等，但沉淀后輔料仍干擾西羅莫司工藝雜質及開環降解雜質的測定；固相萃取法操作繁瑣，需兼顧提取回收率，且樣品處理后部分輔料仍干擾先于西羅莫司色譜峰洗脫的工藝雜質的定量測定；正相色譜法存在多次進樣后，色譜柱柱效明顯下降的現象。因此，為了有效地評價西羅莫司口服溶液的質量，有必要建立通過控制特定降解產物的量評價產品質量的分析方法。

本研究發現：西羅莫司在酸、堿、加熱等條件下均不穩定，在其相對保留時間約為0.6處均有一個較明顯的降解產物色譜峰，經質譜分析及對照品驗證，確認該色譜峰為斷雷帕霉素。穩定性試驗表明，斷雷帕霉素是西羅莫司主要的開環降解雜質，并且其量的增加趨勢和西羅莫司含量的降低呈相關性。因此，本文采用通過控制降解雜質—斷雷帕霉素量的方式間接表征西羅莫司口服溶液的質量。新建的方法專屬性好，重現性好，通用性強，為完善質量標準，有效監控產品質量奠定了基礎。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀(Agilent公司，配備二極管陣列檢測器)；2695型高效液相色譜儀(Waters公司，配備二極管陣列檢測器)；LC-20AD型高效液相色譜儀(Shimadzu公司，配備紫外檢測器)。CP225D型電子天平(德國Sartorius公司)。乙腈，叔丁基甲醚均為色譜純，甲酸銨，甲酸及其他試劑均為分析純，水為Milli-Q超純水。西羅莫司對照品(浙江省食品藥品檢驗研究院，批號：20151112，純度：99.7%，圖1)；斷雷帕霉素(輝瑞制藥有限公司，批號：L20715-182-A，純度：80%，圖1)。西羅莫司口服溶液(A企業，批號160101，規格50mL:50mg；B企業，批號150916，規格50mL:50mg；C企業，批號FKC2602001，規格20mL:20mg；均為國內抽樣樣品)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

圖1 對照品結構式Fig.1 Structures of standard substances

色譜柱：Kromasil100-5 C18(4.6mm×250mm,5μm)；檢測波長為277nm；流動相：以20mmol/L甲酸銨溶液(用甲酸調節pH值至3.6)為流動相A，乙腈(含1%的叔丁基甲醚)為流動相B；按表1進行線性梯度洗脫；流速為1.5mL/min；柱溫為35℃；進樣體積20μL。西羅莫司主峰的保留時間在23～25min之間。

取西羅莫司對照品約5mg，置于5mL量瓶中，加2mL乙腈使溶解，加0.1mmol/L氫氧化鈉溶液1mL，振搖，使混合均勻，加0.1mmol/L鹽酸溶液1mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab. 1 Gradient elution program of mobile phase

2.2 專屬性試驗

經輔料干擾試驗，酸破壞，堿破壞，氧化破壞，加熱破壞和光照破壞試驗知，在建立的色譜條件下，各降解物峰及輔料峰均不干擾斷雷帕霉素和西羅莫司的測定，方法專屬性良好。典型色譜圖見圖2。

2.3 線性關系及相對響應因子的測定

分別取西羅莫司對照品和斷雷帕霉素對照品各約10mg，精密稱定，置于同一100mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。分別精密量取上述儲備溶液各適量，用乙腈按不同比例稀釋制成濃度分別為0.5、1、2、4、5、10、25和50μg/mL的線性溶液。分別精密量取上述溶液各20μL，分別考察在不同色譜系統及不同色譜柱上的響應情況，記錄色譜圖。以濃度(C)對峰面積(A)進行線性回歸分析。以斷雷帕霉素和西羅莫司線性方程的斜率計算斷雷帕霉素相對于西羅莫司的響應因子f，其中f為斷雷帕霉素線性方程的斜率值/西羅莫司線性方程的斜率值，詳見表2。

上述結果表明，斷雷帕霉素和西羅莫司在0.5～50μg/mL濃度范圍內線性關系均良好，斷雷帕霉素相對于西羅莫司的響應因子在0.9～1.1之間。

由于斷雷帕霉素對照品難以大量制備且價格昂貴。因此，本文采用西羅莫司加堿破壞的色譜圖作為標準圖譜，對斷雷帕霉素進行定位，并采用主成分自身對照法定量。

2.4 溶液的制備

2.4.1 供試品溶液

取本品適量，精密稱定，加乙腈稀釋制成約含西羅莫司0.5mg/mL的溶液，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4.2 對照溶液

取西羅莫司對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成每5μg/mL的溶液，作為對照溶液。

2.5 溶液穩定性試驗

取A企業樣品，按“2.4.1”項下制備供試品溶液，在4℃分別放置0、2、4、8、12和24h后，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算斷雷帕霉素的含量，6次測定結果的RSD為1.1%。結果表明，供試品溶液在4℃放置24h內基本穩定。

2.6 重復性試驗

圖2 專屬性試驗HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatograms of specific test

表2 斷雷帕霉素相對響應因子的測定結果Tab. 2 Determination results of the relative response factor

取A企業樣品，共6份，按“2.4.1”項下制備供試品溶液，分別進樣分析，斷雷帕霉素量的平均值為1.0%，RSD為1.4%。重復性良好。

2.7 精密度試驗

取“2.3”項下0.5μg/mL的對照溶液，精密量取20μL，分別連續注入液相色譜儀6次，記錄色譜圖。西羅莫司峰面積的RSD為0.6%。精密度良好。

2.8 檢測限

精密量取“2.3”項下線性對照品儲備溶液適量，加乙腈逐級稀釋，進樣分析。以信噪比S/N=3:1計算檢測限。檢測限為2.3ng(以進樣20μL計)，約相當于0.02%。

2.9 樣品測定

按“2.1”項下的色譜條件，精密量取“2.1”項下的系統適用性試驗溶液20μL，注入液相色譜儀，西羅莫司主峰的保留時間約為24min，相對西羅莫司主峰保留時間約為0.6處的色譜峰為斷雷帕霉素峰，其他色譜峰均不干擾西羅莫司及斷雷帕霉素的測定。A、B和C企業斷雷帕霉素檢出量分別為1.0%、1.3%和0.7%，典型色譜圖見圖3。

3 討論

3.1 現行注冊標準有關物質測定方法的缺陷

西羅莫司口服溶液現行注冊標準分別采用液相色譜法和質譜法控制有關物質的量。其中，液相色譜法控制西羅莫司發酵工藝雜質去甲基西羅莫司，不控制開環等降解產物，標準存在缺陷，并且存在嚴重的輔料干擾現象，測定結果重復性差；質譜法控制本品中的同系物、異構體和降解產物。試驗發現：該方法的缺陷有：①開環降解產物為有機酸，流動相體系為乙腈-水，開環降解雜質保留較弱，易受輔料基質效應影響且離子化效率和其他雜質存在差異。②樣品基質復雜，測定結果重復性差，多次進樣后離子源污染較嚴重。③質譜方法成本高，通用性不強，方法難以推廣。

圖3 系統適用性試驗(1)及供試品溶液(2)典型色譜圖Fig.3 HPLCChromatograms of system suitability test (1) and sample solution (2)

3.2 色譜系統建立的依據

由于西羅莫司及其制劑在各國藥典中均未收載，在比較了現行注冊標準及文獻[6-8]調研的基礎上，通過溶解樣品溶劑的選擇、柱溫、流動相系統的優化(包括流動相組成、流動相pH、緩沖溶液的選擇、流動相中改性劑、互補分離模式的驗證等)等試驗過程，最終新建專屬性良好的，可同時控制西羅莫司開環降解雜質和主要工藝雜質的液相色譜系統[5]，為西羅莫司口服溶液色譜系統的建立奠定了基礎。

3.3 排除輔料對有關物質測定影響的嘗試

西羅莫司口服溶液為黃色澄清黏稠液體。主要輔料為Phosal 50PG，其為復配磷脂，主要為含有溶于丙二醇/乙醇中的約50%磷脂的脂質體形成的組合物[9-10]。由于Phosal組合物具有類似蜂蜜一樣的黏稠度。在分析過程中不可避免會產生輔料干擾問題。

試驗發現：采用西羅莫司原料有關物質檢查方法[5]時，需要在每次進樣后用乙腈沖洗色譜系統30min以上，并且輔料的色譜保留“貫穿”整個色譜分析過程。為優化分析方法，嘗試沉淀離心去除磷脂的方法，但輔料仍干擾部分工藝雜質及開環降解雜質的測定；嘗試采用正相色譜分析系統，利用輔料在正相色譜系統中難保留的特點排除干擾。但是，多次進樣后，柱效顯著下降，需要活化色譜柱后才能繼續檢測；通過正相色譜分析系統建立的思路，嘗試通過固相萃取的方式，除去輔料的干擾，但部分輔料仍干擾先于西羅莫司色譜峰洗脫的雜質的測定。故上述方法均不是口服溶液有關物質檢測的理想方法。

3.4 以斷雷帕霉素的量表征西羅莫司口服溶液質量的合理性分析

在西羅莫司分析方法建立的過程中，試驗發現：西羅莫司在酸、堿、加熱等條件下均不穩定，在相對保留時間約為0.6處均存在較明顯的降解色譜峰，經質譜分析及對照品驗證，確認該色譜峰為斷雷帕霉素。

經穩定性試驗研究，斷雷帕霉素是主要的開環降解雜質，并且其檢出量的增加趨勢和西羅莫司含量的降低呈相關性，詳見表3～4。因此，擬采用通過控制口服溶液中降解雜質—斷雷帕霉素量的方式間接控制西羅莫司口服溶液的質量。為了規避輔料的干擾，在西羅莫司原料有關物質測定方法的基礎上對流動相pH值進行調整，并且增加了梯度過程中乙腈的洗脫時間。試驗證明，新建的方法操作方便，重復性好，通用性強。

3.5 斷雷帕霉素色譜峰定位及定量方式的選擇

由于斷雷帕霉素對照品難以大量制備，且市場上購置的斷雷帕霉素價格昂貴。在沒有對照品的前提下，為了更好地實現對斷雷帕霉素的定位及后續的定量分析，根據西羅莫司原料方法專屬性研究中西羅莫司在堿性條件下易降解產生斷雷帕霉素的現象，在方法中增加堿破壞試驗作為系統適用性溶液，并附標準圖譜，明確斷雷帕霉素的保留行為。由于斷雷帕霉素相對于西羅莫司的響應因子在0.9～1.1之間，因此以主成分自身對照法定量，提高定量結果的準確性。

4 小結

現行西羅莫司口服溶液標準均存在一定的缺陷，難以真實反映產品的質量。本文通過色譜系統的篩選及流動相條件的優化，自建了以主要開環降解雜質斷雷帕霉素的量表征西羅莫司口服溶液質量的方法，為完善質量標準，有效監控產品的質量奠定了基礎。

表3 穩定性試驗斷雷帕霉素量和西羅莫司含量結果Tab. 3 Stability test results of seco-rapamycin and the content of sirolimus

表4 斷雷帕霉素和西羅莫司測定結果相關分析Tab. 4 Correlation analysis result between seco-rapamycin and the content of sirolimus

將開環降解雜質斷雷帕霉素作為表征制劑工藝及貯藏過程中影響產品質量的特定雜質，解決了西羅莫司口服溶液中輔料對檢測造成的嚴重干擾問題。此方法專屬性、重復性好，簡便易行，為復雜體系樣品中有關物質的考察提供了新的思路和方法。