龍膏對順鉑所致腎損傷小鼠的影響

琚皇進 楊柱 唐東昕 羅莉 龍奉璽 王鏡輝 郭斌

【摘?要】?目的：觀察龍膏對小鼠順鉑所致腎損傷的影響。方法：40只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組和龍膏高、中、低劑量組，每組8只，空白對照組不作特殊處理，模型對照組及龍膏高、中、低劑量組以順鉑4mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型，龍膏高、中、低劑量組分別在給順鉑的同時予20mg/kg/d、10mg/kg/d、5mg/kg/d的龍膏灌胃，模型對照組給予同體積生理鹽水灌胃，給藥2周后取小鼠腎臟及血清。通過腎臟HE染色切片觀察其腎小管和腎小管上皮細胞形態改變。ELISA檢測血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及血清胱抑素C（CysC）的含量。結果：龍膏各治療組與模型對照組比較血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）及血清胱抑素C（CysC）均下降，且中劑量龍膏治療組下降的最明顯，療效最好，差異具有統計學意義（P<0.05）。腎臟的HE染色的病理學觀察：龍膏能減輕順鉑所致腎小管的萎縮及其上皮細胞顆粒變性。結論：龍膏對小鼠順鉑所致腎損傷具有改善作用。

【關鍵詞】?龍膏;順鉑;腎損傷;小鼠

【中圖分類號】R285.5???【文獻標志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2019）24-0018-05

Long Gao Mitigate Renal Injury of Mice after Cis-platinum Chemotherapy

JU Huangjin1，2?YANG Zhu1?TANG Dongxin3*?LUO Li3?LONG Fengxi1?WANG Jinghui3?GUO Bin1

1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;2.National Traditional Chinese Medicine Hospital of Dejiang County， Guizhou Province ，Dejiang 565200，China;3.The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China

Abstract：Objective Discussion Long gao influence on mice after cis-platinum chemotherapy， renal coefficients， blood urea nitrogen （BUN）， serum creatinine （Scr）， cystatin C （CysC） and renal pathology slices.Methods Cis-platinum 4mg/kg a single intraperitoneal injection of mice to produced renal impairment， administration 5d.The mice were divided into five groups，Blank control group ：Mouse feeder under conventional conditions， without any treatment;Model control group ：Given the same volume of normal saline （0.2mL/10g） gavage;Long gao high dose group ：Giving cisplatin administered simultaneously 20mg/kg/d of high-dose Long gao gavage;Long gao middle dose group ：Giving cisplatin administered simultaneously 10mg/kg/d of middle-dose Long gao gavage;Long gao low dose group ：Giving cisplatin administered simultaneously 5mg/kg/d of low-dose Long gao gavage;Mice were sacrificed on day 14，take blood and renal，Using kit of ELISA detection of serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、 cystatin C （CysC），renal done pathological section.Results Cisplatin after chemotherapy mice serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、cystatin C （CysC） with before chemotherapy were significantly higher，Long gao treatment serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、 cystatin C （CysC） compared with Model control group decreased significantly， and middle dose Long gao treatment group decreased most significantly， the best effect.Compare with model control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Observation of pathological changes of renal use HE staining：Blank control group： normal renal tissue structures， clear boundaries between the various structures.Model control group： multifocal renal tubular atrophy， with renal tubular compensatory hypertrophy. Tubular epithelial cell denaturation for large number of particles， diffuse infiltration of lymphocytes and monocytes，can seen a lot of tubular protein casts in renal.Three Long gao treatment groups： focal renal tubular epithelial cells granular degeneration， focal lymphocytic infiltration visible focal tubular protein casts.Conclusion Long gao can significantly reduce serum urea nitrogen （BUN）、 serum creatinine （Scr）、 cystatin C （CysC） content，treatment early renal damage induced by cisplatin.To change on the renal pathology is not particularly obvious， but there are still some improvement.

Key?words：Long Gao;DDP;Renal toxicity;Mice

鉑類藥物為大部分腫瘤化療的基石[1]，而順鉑作為臨床中最常用的一種，由于經過腎臟代謝[2]，往往出現嚴重的腎毒性，使得大部分腫瘤病人被迫終止治療;目前西醫針對鉑類藥物所致腎毒性主要通過充分的水化來預防[3]，由于需要長時間大量液體的輸入，使患者生活質量逐漸下降;而中醫藥在預防鉑類藥物腎毒性方面具有其獨特的手段，且往往能獲得佳效。

龍膏[4-5]為我院國醫大師劉尚義教授經驗方，由鹿角膠、生熟地黃、桑椹等31味藥物組成，其主要功效為補腎填精、養心安神，方中鹿膠乃血肉有情之品，其補腎培元為君;生熟地黃活氣血，填精益髓，滋水補陰，能退虛熱兼潤燥，為補腎之圣藥;佐以黃柏等寧神益智、交通心腎;砂仁為使，鼓蕩脾胃之氣，用冰糖者亦有甘溫補中、和中緩急之功，諸藥同用，共奏補腎填精、養心安神之效。且在前期的臨床研究[5]中發現龍膏對鉑類藥物所致腎損傷的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通過動物實驗證明龍膏具有改善順鉑所致腎損傷的作用，初步了解其作用機制，并為臨床運用提供更為有利的證據。

1?材料與方法

1.1?實驗動物?采用6～8周齡雄性清潔級BALB/c近交系小鼠40只，各小鼠體重量（18±2）g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2018-004。

1.2?藥物與試劑?龍膏由貴州中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科按原方比例制備膏劑，其由鹿角膠、生熟地黃、黃柏、砂仁等藥物組成，1g膏方含原生藥材2.73g，4℃冰箱保存備用。順鉑由貴州中醫藥大學第一附屬醫院西藥房提供，規格為10mg/瓶，齊魯制藥有限公司，國藥準字：H20073652，批號：AA1A8036A。

1.3?實驗主要儀器?小鼠血清尿素氮（BUN）定量ELISA檢測試劑盒（批號20181125）;小鼠血清肌酐（SCr）定量ELISA檢測試劑盒（批號20181125）;小鼠血清胱抑素C（CysC）定量ELISA檢測試劑盒（批號20181125）。Nikon-TS100型倒置相差顯微鏡（美國）;HH-S2型水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）;Xiang Yi-L600型離心沉淀機（德國）;萊卡病理切片機（德國）;電子分析天平（北京德賽公司）。

1.4?分組與造模

1.4.1?實驗分組?隨機將40只小鼠分成5組，每組8只，空白對照組，模型對照組，龍膏高、中、低劑量組，并適應性喂養1周[4]。

1.4.2?建立腎損傷模型?分別給模型對照組，龍膏高、中、低劑量組，每組每只小鼠以順鉑4mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型[4]，空白對照組不予處理，給藥5d（前期實驗中發現順鉑給藥5天后小鼠出現尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且腎小管多灶狀萎縮伴部分腎小管代償肥大，提示腎損傷模型造模成功）。

1.5?實驗給藥?實驗前，將龍膏加適量蒸餾水濃縮配制成濃度分別為0.25mg/mL、0.5mg/mL及1mg/mL的水溶液備用。給藥組根據動物藥理實驗用藥折算方法[6]，得出小鼠每日正常給藥劑量等于10mg/kg并設為龍膏中劑量組;設龍膏高劑量組為正常劑量的兩倍為20mg/kg/d;設龍膏低劑量組為正常劑量組的一半為5mg/kg/d;模型對照組給予0.2mL/10g/d蒸餾水灌胃;空白組不作任何處理;隔日稱體重1次，并根據體重變化調整灌胃劑量[4]。

1.6?觀察指標

1.6.1?一般情況?實驗過程中觀察各組小鼠的精神、活躍度、飲食及毛發情況，同時注意各組小鼠是否有飲食差、腹瀉、消瘦及死亡現象。

1.6.2?小鼠體重變化情況?分別稱取小鼠造模前體重及小鼠處死前稱體重，觀察小鼠造模前及用藥后各組的體重變化情況[4，7]。

1.6.3?小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量?龍膏灌胃2周后，禁食24h后稱體重，摘眼球法取血[4]，用離心管迅速接血，常溫靜置1h后，離心，ELISA檢測小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.6.4?小鼠腎臟系數及腎臟病理切片?取出雙側腎臟稱重并計算腎臟系數;將其中一側腎固定于4%多聚甲醛中[4]，進行常規石蠟包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光學顯微鏡下觀察腎小管上皮細胞、集合管上皮細胞及周圍炎性細胞浸潤情況和形態變化。

1.7?統計學方法?數據均采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，多組比較采用方差分析，計量資料以均數加減標準差（x±s）表示，兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）比較，兩組均數比較用t檢驗，P<0.05作為差異具有統計學意義。

2?結果

2.1??一般情況觀察?實驗開始前各組小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05），各組小鼠體重相當，實驗具有可比性。在整個實驗過程中，空白對照組小鼠的精神狀態、活躍程度、進食情況及毛發的光澤度均良好，且小鼠體重逐漸增加;模型對照組及龍膏高、中、低組小鼠則出現不同程度的精神萎靡、活躍度下降、進食減少及毛發光澤度減低且逐漸出現消瘦等情況，而模型對照組的癥狀最為突出，龍膏高、中、低組小鼠狀況稍優于模型對照組。隨著用藥時間的延長，模型對照組小鼠體重逐漸減輕，各龍膏組小鼠癥狀較前稍得到控制，與同期模型對照組動物相比，活動相對增多，反應相對靈敏，飲食較前增加，但與空白組相比仍有不足。

2.2?小鼠順鉑干預前、處死前體重變化比較?本次實驗初始動物總數為40只，每組8只。順鉑干預前各組小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。除空白對照組外其余各組小鼠體重均有明顯下降，且與空白對照組比較差異具有統計學意義（P<0.05），模型對照組與龍膏干預組對比小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3?小鼠腎臟系數比較?模型對照組腎臟系數顯著上升，與空白對照組比較具有統計學意義（P<0.05）;龍膏各劑量組與模型對照組比較腎臟系數均降低，且差異具有統計學意義（P<0.05）;而各龍膏干預組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4?小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量變化?模型對照組與空白對照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均明顯升高，且具有統計學意義（P<0.05）;龍膏各劑量組與空白對照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且具有統計學意義（P<0.05），龍膏各劑量組與模型對照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且具有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.5?各組小鼠腎臟HE染色病理切片情況?空白組：腎組織結構正常，腎小管形態正常，且各結構間界限清晰。模型對照組：腎小管出現多灶狀萎縮伴部分代償性肥大，腎小管上皮細胞出現大量顆粒變性，彌漫淋巴細胞和單核細胞浸潤，腎小管內可見大量蛋白管型。三組龍膏治療組：腎小管上皮細胞局灶性顆粒變性，灶狀淋巴細胞浸潤，可見灶狀的腎小管蛋白管型。如圖1所示。

3?討論

順鉑引起腎臟的損害為現代醫學所公認[8]，通常表現為尿中出現透明管型，血中尿素氨、肌酐及胱抑素C升高等現象。現代中醫認為鉑類藥物乃外來之邪毒[4]，瘀結于腎中致瘀毒互結，傷腎中陽氣，腎陽虧虛以致腎陰陽兩虛，先天受損乃真虛，瘀毒于腎乃假實，固可標本同治，補真虛，瀉假實。近年的中醫學者進行了大量的臨床及動物實驗研究，運用中醫藥針對順鉑所致腎損傷在預防和治療上都取得了巨大進展，其減毒增效的優勢日益顯著。根據中醫理論，各學者從不同方向闡述了其治療順鉑所致腎損傷的觀點如：宋燕等[9]認為，腎為先天，脾胃乃后天，固以溫陽利水為法用以治療順鉑所致腎損傷取得了一定的療效。楊桂染等[10]則認為順鉑所致腎損傷乃心腎兩虛，固其以滋陰安神為法，其效亦可。劉沈林教授[11]認為順鉑所致腎損傷乃脾腎兩虛，固其選用健脾養正消癥方，因其健脾益氣、補腎澀精、解毒消癥之功效能有效的保護化療后的腎功能。劉厚穎等[12]也認為補腎乃第一要務。蔣小燕等[13]認為順鉑所致腎損傷除有腎虛外，仍有邪毒瘀內，固其采用益腎排毒的治療大法。而除了大量復方研究外，單藥治療順鉑所致腎損傷療效亦顯著，如黃芪的益氣固腎，現代學者利用它的提取物及其注射液在臨床上[14-16]用于順鉑所致腎損傷取得了良好的療效，現代醫學對黃芪做了更為深入的研究，其大量的體外實驗[17-18]證明黃芪的益氣固腎對順鉑所致腎損傷的保護作用明顯。

筆者認為精藏于腎，腎精是構成人體和維持生命活動的基本物質，腎精主生長發育、主生殖、生髓、充腦，化生血液（精血互化）[19]，根據“治未病”的理念，固采用“補腎填精，養心安神”為治療大法的龍膏治療順鉑所致腎損傷，方中鹿角膠益精血補腎陽以填髓，生熟地黃滋腎陰，佐桑椹以補陰血，佐黃柏交通心腎、寧神益智，佐仙靈脾等補益元陽，寓陽生陰長，諳合善補陰者必于陽中求陰，陰得陽生則生化無窮，佐以劉寄奴等活血化瘀、升陽化津，補而不滯，砂仁為使，鼓蕩脾胃之氣，使藥力通行全身，用冰糖者亦有和中緩急、甘溫補中之功，諸藥同用，共奏補腎填精、養心安神之效。本方在治療順鉑所致腎損傷的同時而不影響順鉑的療效。

順鉑不僅具有腎臟毒性，且可引起消化系統的反應而出現食欲下降、惡心、嘔吐等癥狀，通過上述實驗發現龍膏對順鉑所致腎損傷后的小鼠體重改善不明顯，可能與該藥物無法改善小鼠胃腸道功能有關;腎臟系數作為評價藥物性腎損傷的指標之一，有其獨特的價值，從上述實驗中發現龍膏對各組順鉑所致腎損傷的小鼠模型腎系數都具有一定的降低作用，提示龍膏對順鉑所致腎損傷有改善作用;臨床評價腎功能最常用指標為血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，這些指標的升高提示腎損傷，而龍膏能降低順鉑所致腎損傷的小鼠體內血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，再次提示龍膏對順鉑所致腎損傷有改善作用;順鉑引起腎損傷的主要靶點為腎小管，使得腎小管上皮細胞變性、壞死，其具有一定的可逆性，而從上述實驗中可得出龍膏能改善順鉑所引起的腎小管損傷。綜上所述，龍膏對小鼠順鉑所致的腎損傷具有一定的改善作用。然而，其具體的分子機制仍有待進一步的深入研究。

參考文獻

[1]李以欣.癌癥化學治療的首選藥物[J].國外醫藥（合成藥 生化藥 制劑分冊），1998（2）：89-96.

[2] Gonzalez vitalejc SD，Haye M，Cvitkovic E.The renal pathology in clinical trials of cisplatinum（Ⅱ）diammine dichloride [J].Cancer，1997，39：1362-1365.

[3] 郭軍華，宋三泰，徐卓立，等.不同水化方案對乳癌患者順鉑腎毒性的影響[J].中華腫瘤雜志，1994（1）：56-58.

[4] 琚皇進，楊柱，唐東昕，等.劉尚義教授經驗方龍膏對荷H_（22）肝癌細胞小鼠順鉑所致腎損傷的影響[J].時珍國醫國藥，2017，28（10）：2343-2345.

[5]琚皇進，楊柱，唐東昕，等.國醫大師劉尚義教授經驗方龍膏干預腫瘤患者化療后腎毒性臨床研究[J].亞太傳統醫藥，2019（7）：122-124.

[6]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛生出版社，1993：33-34.

[7]柯龍珠. 荷H22肝癌細胞小鼠皮下移植和原位移植兩種模型的對比性及葛花解酲方的干預研究[D].貴陽：貴陽中醫學院，2015.

[8]黃永平，周世文.順鉑毒性及防護的新進展[J].中國藥學雜志，1998（4）：11-13.

[9]宋燕.五苓散減輕順鉑腎毒性的臨床觀察[D].濟南：山東中醫藥大學，2013.

[10]楊桂染，李淑貞，劉娜.加味黃連阿膠湯對順鉑所致大鼠腎毒性的影響[J].中國慢性病預防與控制，2010，18（2）：162-163.

[11]吳堅，鄒璽，劉沈林，等.健脾養正消癥方通過激活PI3K/AKT信號通路減輕順鉑所致的腎毒性作用[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（17）：106-110.

[12]劉厚穎，李小維，袁戈，等.濟生腎氣丸加味治療順鉑化療后腎毒性36例[J].時珍國醫國藥，2010，21（8）：2091-2092.

[13]蔣小燕.保元排毒丸干預順鉑腎毒性的研究[D].南京：南京中醫藥大學，2007.

[14]廖開蓮，歐陽周，肖華伍，等.黃芪注射液防護順鉑腎毒性79例臨床觀察[J].醫學臨床研究，2002（8）：461-462.

[15]孔慶志，黃濤，費雁，等.黃芪對大劑量順鉑所致腎毒性防護的臨床研究[J].中國腫瘤臨床與康復，1999（3）：12-14.

[16]陸素琴.黃芪注射液對順鉑所致腎毒性的防護觀察[J].湖北中醫雜志，2004（8）：12-13.

[17]孫舒玉，何小鵑，羅丹，等.黃芪多糖對順鉑治療S180荷瘤鼠的增效減毒作用[J].中國中醫基礎醫學雜志，2013，19（9）：1031-1033.

[18]申雯竹，孔慶志，吳洪斌.黃芪對化療小鼠腎生化指標和病理學的影響[J].湖北中醫雜志，2005（8）：7-8.

[19]琚皇進，楊柱，唐東昕，等.淺談“腎藏精”的物質基礎[J].亞太傳統醫藥，2016，12（10）：42-44.

（收稿日期2019-10-13：?編輯：劉斌）