細菌的嚴謹反應研究進展

張騰飛 羅青平 邵華斌 佘治國

摘要：從嚴謹反應的發生及其分子機制，嚴謹反應影響的生理活動等進行了介紹，并以重要病原菌單增李斯特菌、鏈球菌等為例，闡述了嚴謹反應對細菌生長、代謝、致病性等的調控作用。以期為解析病原菌的環境適應與致病機制及開發新型藥物靶標提供幫助。

關鍵詞：細菌;嚴謹反應;（p）ppGpp信號分子

中圖分類號： ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：1007-273X（2019）12-0014-03

嚴謹反應是細菌在遭受環境壓力和營養不足時，由（p）ppGpp合成酶催化合成信號分子（p）ppGpp，誘導細菌產生的一系列適應性反應。經典的嚴謹反應是由氨基酸饑餓引起核糖體在合成蛋白質時發生空轉反應，（p）ppGpp合成酶通過與核糖體的相互作用感受氨基酸饑餓，合成信號分子（p）ppGpp，從而引發細菌的適應性調控[1]。進一步研究發現嚴謹反應可調控細菌多種生理學功能，例如致病菌的存活、復制和傳播。因此研究細菌的嚴謹反應對于解析細菌的環境適應與致病機制與開發新型藥物靶標具有重大的意義。

1 ?嚴謹反應的產生

早在40多年前，Cashel和Gallant第一次發現了四磷酸鳥苷（ppGpp）和五磷酸鳥苷（pppGpp），簡稱為（p）ppGpp類物質。當在氨基酸饑餓條件下，大腸桿菌的細胞通過放射性核酸二維薄層色譜檢測到了信號分子，即薄層上的“magic spots”-（p）ppGpp，它是由GDP或GTP從ATP上轉移磷酸所合成，與rRNA合成的停止相關。由于細菌感應應激環境產生信號分子（p）ppGpp，進而調節自身的行為以適應環境，因此（p）ppGpp介導的調控反應被定義為嚴謹反應[1]。

信號分子（p）ppGpp的水平由兩類酶控制，這兩類酶分別是只具有合成活性的單功能酶和既能合成又能水解的雙功能酶。雙功能酶的命名目前沒有明確標準，在大腸桿菌中單功能酶被命名為RelA，雙功能酶被命名為SpoT，或者RSH（RelA/SpoT同源蛋白）被稱為雙功能酶。在大腸桿菌中，單功能RelA蛋白和雙功能SpoT蛋白都能從ATP上獲得磷酸，加載到GDP或GTP上形成ppGpp或pppGpp，但是只有雙功能酶才可以水解（p）ppGpp成GDP或GTP和PPi。大部分革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌和沙門氏菌都編碼RelA和SpoT。如果沒有SpoT，細菌則不能降解RelA合成的（p）ppGpp，導致不能減少的核酸積累破壞細胞的周期調控。在這些物種中，SpoT的功能一般在缺乏合成活性的ΔrelAΔspoT雙缺菌株[（p）ppGpp0]中被研究。其他的許多致病菌編碼（p）ppGpp的途徑與RelA/SpoT雙酶模式截然不同。例如，結合分枝桿菌、變形桿菌、布氏桿菌等僅編碼一個雙功能RSH蛋白，而一些革蘭氏陽性厚壁菌門，如鏈球菌、芽孢桿菌等不但可以編碼一個雙功能RSH蛋白（選擇性稱為Rel或RelA），而且還可以編碼其他一些小的RelA樣的合成小片段蛋白（RelP和RelQ）。另外，伽馬變形菌和霍亂弧菌可以編碼RelV和截斷的合成酶[2-4]。多種酶的存在致力于信號分子的合成和水解，說明了細菌進化出多種功能機制來調控（p）ppGpp的水平。

2 ?嚴謹反應調控細菌的多種生理學功能

（p）ppGpp作為信號分子促進細菌的適應和應變能力是其主要功能。為了監測和適應自身所處的環境，細菌依靠其感應系統來調控復雜的生理過程。比如，細菌面對環境壓力，更易于調節自身的耐受程度和營養利用途徑。像所有的微生物一樣，每種病原菌最根本的目標都是存活與復制。然而，為了克服宿主強大的防御機體，病原菌通常需要被賦予毒力相關的性能，例如表面附著，細胞或組織的侵入和傳輸。很多病原菌都有獨特的毒力傳播途徑和更廣泛的適應性途徑，比如抗應激能力，通過調整特異的調節子調控全局性的信號網絡，包括重要的碳源和氮源代謝途徑[5，6]。許多細菌都是依靠核苷酸分子治愈自身的代謝紊亂和協調其生存和毒力的平衡。

在宿主的復雜環境中，致病菌改變他們的新陳代謝和所利用的蛋白質去響應環境的變化。為了搶占先機，致病菌可能激活特異的分泌系統、運動細胞器或粘附素等。這樣，毒力因子可以促進微生物獲得營養，增加自身存活率，調控宿主細胞的生物或免疫系統，或讓自己處于更有利的環境中。為了應答環境，病原菌利用專門的調節子改變它們的響應方式。許多毒力調節子的表達和激活被融入了（p）ppGpp調節的全局性響應中，從而耦合了致病菌的代謝狀態。就其本身而論，細胞內（p）ppGpp水平的調控對致病菌的存活、復制和傳播非常重要。

雙功能（p）ppGpp合成/水解蛋白在革蘭氏陽性菌中至關重要。例如，在金黃色葡萄球菌中，SpoT蛋白的同系物 （稱為RelA）對金黃色葡萄球菌的體外生存非常重要。厚壁菌門的其他成員依賴嚴謹反應調節自身的全局性生理變化，這種現象也與致病性相關，例如在環境中的持久性和抗生素的耐藥性問題。舉例說明，能引起肺部炭疽熱并在環境中長期存活的炭疽芽孢桿菌依賴relA的存在。醫院內越來越普遍的艱難梭菌經常暴露于抗微生物的試劑中，有文獻報道當阿莫西林和克林霉素存在時能夠上調（p）ppGpp合成/水解酶的表達。

3 ?多種病原菌中的嚴謹反應

3.1 ?嚴謹反應與單增李斯特菌

單增李斯特菌能夠引起罕見致命的食源性疾病。雖然其感染之后的表現可能僅僅引起非侵入性胃腸炎，但是嚴重的情況下也可以導致敗血癥和腦膜炎。這種感染可能反映了潛在的病原菌能夠侵入宿主細胞，促進細胞至細胞的傳播現象。雖然relQ和relP在李斯特菌的基因組中被鑒定，但是迄今為止只檢測到一個雙功能酶spoT同系物，稱之為Rel或RelA[7]。單增李斯特菌中的（p）ppGpp可以影響生物被膜的形成，缺失了relA的突變株生長出現缺陷，粘附表面的能力也降低。當單增李斯特菌缺失relA后，表現出在培養的細胞系中存活能力降低的現象，包括Caco-2腸上皮細胞和J774. A1巨噬細胞。而由于單增李斯特菌感染引起的嚴謹反應目前尚不清楚，已報道的兩組老鼠感染細菌的實驗出現了沖突的結果，因此還需要進一步深入研究。單增李斯特菌的relA缺失突變株維持一定的毒力并依然具有（p）ppGpp的合成活性，Taylor等發現突變株毒力降低可能是由于（p）ppGpp產物的減少。Okada等[8]和Bennett等[9]報道細菌單增李斯特菌在肉湯和培養的細胞系中生長證明了（p）ppGpp適應環境就像面對宿主感染一樣。

3.2 ?嚴謹反應與化膿鏈球菌

A群鏈球菌（GAS）在人體宿主內也能適應各種各樣的環境。GAS被證實能夠引起各種感染，包括膿包瘡（影響皮膚）、肺炎和腦膜炎，包括分泌酶和外毒素等相關毒力因子的表達和其生長過程的營養代謝情況息息相關，特別是對（p）ppGpp的利用尤為重要[10]。和其他革蘭氏陽性菌一樣，化膿鏈球菌有兩個具有（p）ppGpp合成功能的同源小蛋白RelQ和RelP以及一個雙功能蛋白RelA。 因此GAS也能產生不依賴RelA的嚴謹反應。雖然細菌進入平臺期之后，relA的轉錄譜上調了2倍，但是許多研究工作揭示了在氨基酸饑餓的條件下化膿鏈球菌的嚴謹反應可以不依賴RelA。這條通路影響了重要毒力基因的表達。例如調節生長的轉錄因子RopB，其可以支配分泌蛋白酶外毒素B的speB基因的表達;還能影響雙組份調控系統covRS的表達，從而調節溶血素S、鏈激酶和外毒素B的表達;與寡肽吸收和進程有關的因子opp和dpp通透酶系統和pepB基因也受其影響。氨基酸饑餓能誘導fas操縱子調節毒力和autoinducer-2蛋白的變化。不依賴relA的基因，包括轉運蛋白、代謝酶和至少兩個毒力基因也受到了影響[11]。

3.3 ?嚴謹反應與肺炎鏈球菌

像腸球菌和GAS一樣，α-溶血性鏈球菌，比如肺炎鏈球菌能引起廣泛的組織趨向性，造成心內膜炎、中耳炎和菌血癥。在肺炎鏈球菌中，通過信號標簽誘變篩選鑒定出一個雙功能rel基因，其在肺炎小鼠模型中對菌株保持毒力有著非常重要的作用[12]。肺炎鏈球菌還編碼一個RelQ的同系物，但只能在異源系統中合成（p）ppGpp而不能在其自身細菌體內作用。肺炎鏈球菌菌株D39的嚴謹反應依賴rel，可顯著誘導ply基因的表達。ply基因編碼肺炎球菌的溶血素，能夠通過其細胞毒性誘導炎癥反應，促進細菌早期感染和侵入肺組織而進入血液循環。缺失ply后，肺炎鏈球菌對小鼠的毒力顯著減弱。肺部感染缺失rel基因的D39菌株后，缺失株對小鼠表現為無毒現象[13]。雖然ply可能受其他一些方式調控，但是其依賴rel的調控作用是肺炎鏈球菌調控毒力的一個重要部分。

3.4 ?嚴謹反應與變形鏈球菌

變形鏈球菌是引起齲齒疾病的重要病原菌。為了適應口腔內環境，變形鏈球菌能夠形成生物被膜，抵抗環境中的不利因素，其對低pH和流動的營養成分具有耐受力。變形鏈球菌中信號分子（p）ppGpp的代謝也是很復雜的。該細菌有三個（p）ppGpp合成酶，一個雙功能RelA蛋白和兩個單功能蛋白，分別是RelQ和RelP酶。當細菌面對莫匹羅星處理過的氨基酸饑餓條件時，與糖代謝、生物被膜和遺傳能力相關的基因表達便會發生變化。然而，通過判斷比較野生菌株和relA突變株的應答反應，研究者發現其中的一些基因并不依賴RelA蛋白。另一方面，在高濃度的碳水化合物的培養基中relA基因的缺失讓細菌的生長受到了限制，一些特定糖底物也受到了異常調節。研究發現突變株ΔrelA的生物被膜形成能力更弱，然而缺失了relA之后的生物被膜對酸的耐受能力增加[14]。關于這3個調節（p）ppGpp的合成酶之間的聯系仍然需要更進一步的研究。

4 ?展望

由此可見，細菌的嚴謹反應通過調控細菌的代謝、毒力因子表達等一系列生理活動，影響了細菌的環境適應能力與致病性，深入研究病原菌的嚴謹反應，對解析病原菌的致病機制，開發靶向藥物具有重要意義，也將是一個研究的熱點。

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