細針穿刺BRAF單基因檢測在甲狀腺微小乳頭狀癌中的診斷價值

林恩德 傅錦波 林福生 陳清貴 羅曄哲 洪曉泉 吳國洋

[摘要] 目的 探討術前細針穿刺BRAF基因檢測在甲狀腺微小乳頭狀癌中的臨床價值。方法 回顧性分析廈門大學附屬中山醫院普通外科2017年4月—2018年12月共328例甲狀腺結節手術患者臨床資料。其中<1 cm結節153例患者，≥1 cm甲狀腺結節175例患者，根據手術后組織病理學結果，觀察兩組細針穿刺細胞學結果及BARF基因突變表達情況。計算細針穿刺細胞學、BRAF基因突變和兩者聯合診斷的敏感性、特異性及準確性，組間比較采用McNemar配對資料2檢驗。結果 以結節直徑分為兩組，<1 cm結節組中，FNAC在判斷結節良惡性的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率分別是88.2%、95.2%、99.2%、54.1%、89.1%;BRAF基因突變檢測在判斷結節良惡性的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率分別是91.0%、100.0%、100.0%、61.8%、92.1%;≥1 cm結節組中，FNAC在判斷結節良惡性的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率分別是88.8%、100.0%、100.0%、78.1%、94.3%;BRAF基因突變檢測在判斷結節良惡性的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率分別是77.6%、98.0%、99.0%、63.6%、83.4%。 結論 單基因檢測BRAF突變在<1 cm結節中比FNAC有更好的診斷能力，是甲狀腺微小乳頭狀癌一個可靠的診斷指標。

[關鍵詞] 甲狀腺微小乳頭狀癌;細針穿刺;BRAF基因突變;術前診斷

[中圖分類號] R5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）12（a）-0033-03

[Abstract] Objective To explore the diagnostic value of preoperative fine needle aspiration BRAF gene detection in thyroid micropapillary carcinoma. Methods A retrospective study was conducted on the clinical data of 328 patients with thyroid nodules who underwent surgery in the Zhongshan Hospital Xiamen University from April 2017 to December 2018. 153 patients with <1 cm nodules and 175 patients with ≥1 cm thyroid nodules were observed. The sensitivity， specificity and accuracy of FNAC， BRAF gene mutation and combined diagnosis were calculated. Results In the <1 cm nodule group， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of FNAC were 88.2%， 95.2%， 99.2%， 54.1% and 89.1% ，respectively， and the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of BRAF gene mutation detection were 91.0%，100.0%， 100.0%， 61.8%， 92.1% ，respectively; In the group of ≥1 cm nodule group， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of FNAC were 88.8%， 100.0%， 100.0%， 78.1% and 94.3%， respectively; The sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of BRAF gene mutation detection were 77.6%， 98.0%， 99.0%， 63.6% and 83.4%， respectively. Conclusion Single gene detection of BRAF mutation in nodules <1 cm has better diagnostic ability than FNAC.

[Key words] Thyroid micropapillary carcinoma; Fine needle aspiration; BRAF gene mutation; Preoperative diagnosis

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，在我國甲狀腺癌成為近年來增長最快的惡性腫瘤之一[1]，其中甲狀腺微小乳頭狀癌的發病率呈顯著上升，主要的原因在于高頻超聲篩查的普及，提高了<1 cm甲狀腺結節的檢出率。彩色多普勒超聲主要通過甲狀腺結節的回聲、邊界、縱橫比、鈣化、血流情況等特征來判斷良惡性。甲狀腺細針穿刺細胞學（Fine needle aspiration cytology，FNAC）目前作為指南推薦的診斷甲狀腺結節的“金標準”[2]，雖然有著簡便、安全、可重復性高等優點，但仍受到取材質量、病理學醫師個人經驗等限制。該文回顧性分析廈門大學附屬中山醫院普通外科2017年4月—2018年12月共328例甲狀腺結節手術患者臨床資料，擬通過聯合FNAC和BRAF基因檢測，探討BRAF基因對甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷價值，報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便選取該院就診術前同時進行FNAC及BRAF基因檢測的328例手術患者作為研究對象，共340枚結節。術后病理證實，144枚為甲狀腺微小乳頭狀癌，125枚為甲狀腺乳頭狀癌，71枚良性甲狀腺結節患者。以結節直徑為標準分為兩組，在<1 cm組中，男性36例，女性117例，年齡18～71歲，平均（45.1±10.2）歲;≥1 cm結節組中，男性41例，女性134例，年齡8～75歲，平均（49.7±13.6）歲。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2? 方法

1.2.1? 細針穿刺方法? 患者取仰臥位，頸前區皮膚消毒，鋪無菌洞巾。西門子SEQOUTA型超聲探查甲狀腺結節，25G針頭在超聲引導下進入可疑結節，無負壓反復提插10～15次，注射器針筒吸取4～5 mL空氣將針頭內的標本推至載玻片上，95%乙醇固定玻片，HE染色。再留取一針細胞樣本置2 mL生理鹽水的離心管中，4℃冰箱保存。

1.2.2? 細胞學診斷方法? 細胞涂片由同一位細胞病理學醫師判讀。按Bethesda分類標準將標本分為6類：標本無法判斷或不滿意、良性濾泡性結節、意義不明確的細胞非典型病變、濾泡性腫瘤、可疑惡性腫瘤、惡性腫瘤。該研究將可疑惡性腫瘤和惡性腫瘤歸類為細胞學陽性，將其余4種定義為細胞學陰性。

1.2.3? DNA的提取及BRAF基因突變檢測? 3 000 g離心細胞學標本10 min，去除上清液。BRAF基因的檢測采用突變擴增阻滯系統（amplification refractory mutation system，ARMS）法，使用人類BRAF 基因V600E突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫藥科技有限公司）。設計引物，上游：5-TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3;下游：5-GGC CAA AAA TTT AATCAG TGG A-3，常規反轉錄生成cDNA。解凍混合液，并與Taq酶、待測DNA樣品以20∶0.25∶5的比例混勻，置入PCR儀進行擴增。于60℃時收集FAM 和HEX 信號。樣本Ct≥28為陰性，樣本Ct<28為陽性。

1.3? 統計方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用（x±s）表示，行t檢驗，計數資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? FNAC及BRAFV600E檢測結果

在269枚甲狀腺乳頭狀癌中，有228枚存在BRAF突變。良性結節中術后病理結果55枚結節性甲狀腺腫，15枚甲狀腺濾泡性腺瘤，1枚慢性淋巴細胞甲狀腺炎。見表1。

2.2? FNAC及BRAF基因突變檢測在診斷甲狀腺良惡性結節中的價值比較

將所有結節分成<1 cm結節組和≥1 cm結節組，以手術組織病理為金標準進行比較。相對于單一進行FNAC檢查，FNAC聯合BRAF基因突變在兩組結節中的敏感度、特異度等指標均較高，差異有統計學意義（P<0.05）;在<1 cm結節組中，BRAF突變檢測的敏感度、特異度及準確度均高于FNAC，差異有統計學意義（P<0.05）;而在≥1 cm結節組中，BRAF突變的敏感度、特異度及準確度均低于FNAC，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表2、表3。

3? 討論

2014年世界衛生組織公布的數據中顯示，甲狀腺癌的新發病例中有50%以上是微小乳頭狀癌。超聲引導下細針穿刺細胞學檢查被認為是目前鑒別甲狀腺良、惡性結節最準確的方法。小于1 cm的甲狀腺結節進行細針穿刺時，結節內提插路徑較短，針尖反復進出結節，同時由于“部分容積效應”，導致有效取材量不足。Moon等[3]研究了1 440個微小結節的FNAC結果，發現結節直徑每減少1 mm，標本不滿意率持續升高。該研究中，FNAC在<1 cm的結節里的準確度為89.1%，而在≥1 cm結節里的準確度為94.3%，顯示出FNAC在甲狀腺微小結節診斷中有一定的局限性。而細針穿刺標本中，約有7.5%的細針穿刺細胞學診斷為不典型細胞[4]。這部分病例可能造成外科醫師的困惑，激進的診斷性手術可能會造成手術并發癥及甲狀腺缺失引起的甲狀腺激素終身替代;保守的觀察也許會導致惡性腫瘤的進展及遠處轉移。

BRAF基因作為RAF-MEK-ERK信號轉導通路中的重要成員，在腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等方面發揮重要作用。BRAF V600E基因突變在甲狀腺乳頭狀癌中的檢出率為66.2%～72.2%，與經典型和預后差直接相關[5-6]。該研究病例中有84.8%的甲狀腺乳頭狀癌中存在BRAF突變，較以往報道較高，可能原因為該研究使用ARMS法進行BRAF基因突變檢測，敏感性相對傳統Sanger測序法高[7]。而該次首次提出，在<1 cm結節內，單基因BRAF突變檢測有92.1%的準確度，強于FNAC的89.1%。原因在于基因檢測的個人經驗因素少，診斷特異性強，相比FNAC更能夠提供給外科醫師確鑿的診斷結果。總共有23例患者（7.2%）細胞學為陰性，但因為BRAF檢測為陽性，行手術治療證實為甲狀腺乳頭狀癌。但必須注意到，有極少數病例在良性甲狀腺腫瘤中檢測出BRAF突變 [8]。該研究亦有1例患者術前穿刺BRAF檢測出突變，術后病理證實為結節性甲狀腺腫，考慮為癌前病變可能。根據該中心的經驗，在<1 cm的微小結節進行細針穿刺活檢時，建議同時聯合檢測BRAF突變，避免患者因細胞診斷不明確而進行二次穿刺，增加診療時間及患者心理負擔。

綜上所述，單基因檢測BRAF突變在<1 cm結節里體現出強于FNAC的診斷價值，可作為甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷可靠的分子標志物。