垂枝紅千層內生真菌的分離鑒定及其生物活性

李賽妮 陳玉嬋 劉洪新 朱牧孜 章衛民

【摘?要】?目的：研究垂枝紅千層內生真菌的分離鑒定及其生物活性，為進一步發掘活性代謝產物奠定基礎。方法：通過組織分離法分離培養垂枝紅千層內生真菌，通過ITS序列分析對分離的真菌進行鑒定，并采用濾紙片法和SRB法對內生真菌的發酵液提取物進行抗菌和細胞毒活性研究。結果：共分離得到29個菌株，鑒定為17屬20種，其中以黑孢霉屬（Nigrospora）、間座殼屬（Diaporthe）和刺盤孢屬（Colletotrichum）為優勢類群;菌株A797、A798和A809的發酵提取物，對金色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有較好抑制活性（抑菌圈直徑≥13?mm）;當發酵液提取物的作用濃度為100?μg/mL時，菌株A781、A785和A805對4株受試腫瘤細胞均具有較明顯的抑制作用（抑制率≥90%以上）。結論：垂枝紅千層內生真菌多樣性豐富，部分菌株具有較好的抗菌和細胞毒活性，值得進一步深入研究。

【關鍵詞】?紅千層;內生真菌;分離鑒定;抗菌活性;細胞毒活性

【中圖分類號】R285.5?【文獻標志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0016-06

Isolation，?Identification?andBiological?Activities?of?Endophytic?Fungi?from?Callistemon?viminalis

LI?Saini?CHEN?Yuchan?LIU?Hongxin?ZHU?Muzi?ZHANG?Weimin*

State?Key?Laboratory?of?Applied?Microbiology?Southern?China/Guangdong?Provincial?Key?Laboratory?of?Microbial?Culture?Collection?and?Application/?Guangdong?Open?Laboratory?of?Applied?Microbiology/?Guangdong?Institute?of?Microbiology，Guangzhou?510070，?China

Abstract：Objective?To?isolate?and?identify?endophytic?fungi?from?Callistemon?viminalis?and?investigate?their?biological?activities，?thus?providing?a?theoretical?basis?for?further?searchfor?biologically?activemetabolites.Method?Endophyticfungiwereisolated?and?purified?from?C.?viminalis?by?tissue?isolation?method?and?identified?by?analysis?of?ITS?sequences.?Antibacterial?and?cytotoxic?activities?of?fermentation?broth?extracts?of?these?endophytic?fungi?were?examined?by?the?filter?paper?dispersion?method?andthe?Sulforhodamine?B（SRB），?respectively.?Results?29?strains?were?isolated?and?identified?as?20?species?in?17?genera，?among?which?Nigrospora，?Diaporthe?and?Colletotrichum?were?the?dominant?genera.?The?fermentation?extracts?of?strains?A797，?A798?and?A809?showed?inhibitory?activity?against?Staphylococcus?aureusand?Escherichia?coliwithinhibitionzone?diameters?of?over?13?mm.?The?strains?A781，?A785?and?A805?exhibited?cytotoxic?activity?against?the?tested?tumor?cell?lines?with?inhibitory?rates?of?over?90%when?the?concentration?of?their?fermentation?extracts?was?100?μg/mL.?Conclusion?Endophytic?fungi?from?C.?viminalisare?rich?in?diversity?and?several?strains?showed?antibacterial?and?cytotoxic?activities，?which?deserved?further?study.

Keywords：Callistemon?viminalis;?Endophytic?fungi;?Isolation?and?Identification;?Antibacterial?Activity;?Cytotoxicity

植物內生真菌（Endophytic?fungi）是一類重要的微生物資源，其生活在植物體內的特殊環境中，在演化過程中與宿主植物形成了互惠共生關系，能產生與宿主相同或相近的代謝產物，甚至能產生新型生物活性物質，在醫藥、農業以及病蟲害的防治等領域具有重要的應用價值，已成為國內外研究的熱點領域[1]。

垂枝紅千層（Callistemon?viminalis）為桃金娘科（Myrtaceae）紅千層屬（Callistemon）植物，原產于澳大利亞，國內多個地區都有栽種，廣泛用于綠化、園藝觀賞、入藥和制取精油等[2]。紅千層屬植物的化學成分和生物活性研究表明，其枝葉含有間苯三酚類及黃酮類等化合物[3-5]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲和免疫調節等多種生物活性[6-8]。迄今垂枝紅千層內生真菌及其代謝產物研究未見報道。為了充分發掘該植物的內生真菌資源，本研究對采自華南植物園的垂枝紅千層進行內生真菌的分離和鑒定，探討垂枝紅千層內生真菌的多樣性，并對分離到的內生真菌的發酵粗提物進行抗菌和細胞毒活性研究，旨在篩選出具有生物活性的菌株，為進一步研究其活性代謝產物提供理論依據。

1?材料與儀器

1.1?材料

1.1.1?植物材料、供試菌株及細胞株?垂枝紅千層健康植株于2016年01月采自廣州華南植物園。

供試指示菌細菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus，SA）?、大腸桿菌（Escherichia?coli，EC）、枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis，BS）。

供試腫瘤細胞株為神經膠質瘤細胞（SF-268）、乳腺癌細胞（MCF-7）、大細胞肺癌細胞（NCI-H460）、肝癌細胞（HepG-2）。以上所有菌株和細胞株均保藏于廣東省微生物研究所。

1.1.2?培養基分離?培養基為PDA雙抗培養基：馬鈴薯?200g，葡萄糖?20g，KH2PO4?3g，KH2PO4?3g，MgSO4·7H2O?1.5?g，維生素B1?10?mg，瓊脂18?g，蒸餾水1?L;滅菌后分別加入100?μg/mL硫酸卡那霉素和氨芐青霉素。

PD液體培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，?KH2PO43g，MgSO4·7H2O?0.15g，維生素B110mg，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃下滅菌30min。

腫瘤細胞培養基為含有10%胎牛血清和1%雙抗（10000?U/mL青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640基礎培養基，混合均勻，4℃冰箱保存。

1.1.3?試劑RPMI-1640?培養基、胎牛血清、雙抗（10000?U/mL青霉素+鏈霉素）均購自Gibco公司;磺酰羅丹明B（SRB）、二甲基亞砜（DMSO）、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、順鉑（cisplatin）均購自Sigma公司;乙醇、乙酸乙酯、甲醇等其他分析純化學試劑購于廣州化學試劑廠，用于基因擴增的Taq酶及其他的PCR相關試劑購于廣州美基生物科技有限公司。

1.1.4?主要儀器YXQ-WY21-600?電熱高壓蒸汽滅菌鍋，廣州市華南醫療器械有限公司;Mastercycler?gradient?5331?PCR儀，Eppendorf公司;MGC-250BP-2?培養箱，上海一恒科技有限公司;164-5050?Powerpac?Basic?Power?Supply基礎型電泳儀，Bio-Rad公司;DMI3000B倒置顯微鏡，Leica公司;S-3000N掃描電鏡，日立公司;Multiskan酶標儀，Thermo公司;2123-2二氧化碳培養箱，Shellab公司;RE-2000?旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;THZ-C-1搖床，廣州市正一科技有限公司。

2?方法

2.1?內生真菌的分離純化?將采集的新鮮樣品用清水沖洗，然后用無菌水漂洗2次，放入75%的乙醇中浸泡1min，取出后用無菌水漂洗3次，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡1min，取出后用無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干水分。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5cm?×?0.5cm的方塊;枝條用無菌手術剪去兩端，取中間部位剪成1cm長的小段;用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對照。處理好的樣品放入事先準備好的PDA雙抗平板培養基中，每個培養皿接種4塊相同類型組織塊，26℃恒溫培養5～7d，待培養基上可觀察到從組織塊內部向周圍長出菌絲時，挑取形態不同的菌落轉移到新培養基上繼續培養直至純化后，將菌株轉接到裝有PDA培養基的斜面上，置于4oC冰箱保存，備用。

2.2?內生真菌的鑒定?采用真菌基因組DNA提取試劑盒（Magen）提取內生真菌的基因組DNA，作為PCR擴增的模板[9]。PCR擴增采用真菌rDNA內轉錄間隔區（rDNA?ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）[10]擴增分離菌株的rDNA?ITS區。PCR采用40?μL反應體系，通過Ex??Taq（TaKaRa）進行，反應條件為94℃預變性5min;94℃變性45s，55℃復性30s，72℃延伸1min，共35個循環;最后72oC延伸5min。反應產物用1%瓊脂糖凝膠跑膠驗證，將有目的條帶的反應產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析，對分離菌株進行鑒定。

2.3?菌株粗提物浸膏的制備?將4?℃低溫保藏的菌株分別接種到PDA平板上，27?℃活化?3?d，挑取各菌株接種到PD液體培養基中，28?℃、120?r/min條件下搖床培養?7?d，用四層紗布過濾收集發酵液。用乙酸乙酯等體積萃取發酵液4次，合并萃取液于45℃減壓濃縮，得到各菌株粗提物浸膏。取以上各菌株發酵液粗提物適量，稱重，備用。

2.4?抗細菌活性測定?將各供試細菌接種于營養瓊脂液體培養基中，37℃培養24h，用無菌生理鹽水稀釋，配制成?1×105～1×107CFU/mL的菌液。吸取?1mL菌液于滅菌的培養皿中，倒入已冷卻到合適溫度的營養瓊脂培養基中，混合均勻，待冷卻之后放置己滅菌的直徑為?6mm濾紙片，分別吸取提取液?5μL滴加于濾紙片上，以DMSO代替樣品提取液作空白對照，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以氨芐青霉素作陽性對照，大腸桿菌以硫酸卡那霉素作陽性對照。置37℃恒溫箱培養16～24h，觀察細菌生長情況并測量抑菌圈大小。

2.5?細胞毒活性測定?采用SRB法[11]測定發酵提取物的細胞毒活性。取對數生長期的NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2細胞，用胰酶消化，臺盼藍染色計數。臺盼藍排斥實驗檢測細胞活力大于95%后，用新鮮培養基調整細胞濃度為3×104?個/mL，細胞接種于96孔板，每孔加入180μL的細胞懸液，并設空白孔調零，于37?℃、5%?CO2培養箱培養24h。待細胞貼壁后，每孔加入20μL待測樣品，陰性對照加20μL培養基，以順鉑作陽性對照。置CO2培養箱中培養72h后，加入50μL?50%冷三氯醋酸固定細胞，4℃放置1h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1%冰醋酸配制的SRB溶液（4mg/mL）100μL/孔，室溫中染色30min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后每孔加入200μL濃度為10mmol/mL的Tris溶液，用酶標儀測定570nm處的吸光度（A）值，按以下公式計算提取物對細胞生長的抑制率：

細胞生長抑制率（%）?=?（1-A樣品組/A對照組）?×100%

3?結果

3.1?內生真菌的分離與鑒定?從垂枝紅千層的莖、葉中分離到29株內生真菌，將測序后獲得的ITS序列提交至NCBI數據庫進行BLAST分析并獲得登錄號，結果見表1。從表1可以看出，分離菌株鑒定為17屬20種，未鑒定至種名的有4?株;其中以黑孢霉屬（Nigrospora）、間座殼屬（Diaporthe）和刺盤孢屬（Colletotrichum）為優勢類群，共12株，占分離菌株總數的41.37%;而菌株A797和A805與最相似物種的相似度較低，分別是96.3%和93.3%，有待進一步鑒定。

3.2?內生真菌的抗細菌活性?29株內生真菌中有9個屬11株真菌的提取物至少對1種供試細菌有抗菌活性（抑菌圈直徑≥8?mm），占分離菌株總數的37.9%，對2種供試細菌有抑制作用的活性菌株有3株，占分離菌株總數的10.3?%。其中對SA和BS都具有較好抑制活性（抑菌圈直徑≥13?mm）的菌株有3株，分別是菌株A797、A798和A809;所有內生真菌的提取物對大腸桿菌均沒有明顯的抑制作用。見表2。

3.2?內生真菌的抗腫瘤活性?各菌株發酵液粗提物的體外細胞毒活性測試結果見表3。從表3中可以看出，當粗提物的濃度為100μg/mL時，29株內生真菌中共有6個屬10株真菌提取物至少對1種供試細胞株有抑制作用（抑制率≥50%以上），占分離菌株總數的?34.5%;對4株受試腫瘤細胞均具有顯著活性（抑制率≥90%以上）的菌株有3株，分別是菌株A781、A785和A805。

4?討論

紅千層屬植物的化學成分和生物活性已有大量的研究報道。本研究首次對垂枝紅千層的內生真菌多樣性及其生物活性進行探索，從中分離獲得了29株內生真菌，經ITS序列分析鑒定為17屬20種，其中以黑孢霉屬、刺盤孢屬和間座殼屬為優勢類群。通過對內生真菌發酵粗提物的抗細菌和抗腫瘤活性測試，發現有9個屬11株真菌提取物至少對1種供試細菌有抗細菌活性（抑菌圈直徑≥8mm），其中菌株Pseudofusicoccum?violaceum?A797、Amesia?gelasinospora?A798和Botryosphaeria?dothidea?A809的發酵提取物，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有較好抑制活性（抑菌圈直徑≥13mm）;細胞毒實驗結果表明，當內生真菌粗提物濃度為100μg/mL時，共有6個屬10株真菌提取物至少對1?種受試細胞株有抑制作用（抑制率≥50%?以上），其中菌株Guignardia?mangiferae?A781、Nigrospora?sphaerica?A785和Diaporthe?phaseolorum?A805對SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2?4種受試細胞的抑制率均在90%以上。結果表明，垂枝紅千層內生真菌具有較為豐富的物種多樣性，且部分菌株具有較好的生物活性，為進一步研究垂枝紅千層內生真菌活性代謝產物奠定基礎，并為開發利用垂枝紅千層資源提供了科學依據。

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（收稿日期：2019-09-24?編輯：劉?斌）

基金項目：國家自然科學基金項目?（31600271）;廣東省科技計劃項目（2107A020211023）;廣州市珠江科技新星項目?（201806010080）。

作者簡介：李賽妮（1991-），女，漢族，本科，研究方向為微生物資源與應用技術。E-mail：1119606031@qq.com

通信作者：章衛民（1965-），男，漢族，博士，研究員，研究方向為藥用微生物資源及其活性物質研究。E-mail：wmzhang58@qq.com