慢性乙型肝炎治愈新藥研究進展*

張 茜，胡 鵬

據2016年世界衛生組織報道，全球約有2.4億慢性HBV感染者，每年約有65萬人死于慢性HBV感染導致的肝硬化或肝癌[1]。2017年歐洲肝病研究學會對乙型肝炎治愈作出定義：（1）完全治愈（complete sterilizing cure），即血清HBsAg完全檢測不到，HBV DNA徹底清除，包括共價閉合環狀DNA（cccDNA）和整合的HBV DNA；（2）功能性治愈（functional cure），即在有限的治療療程結束后血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到，伴或不伴HB－sAg血清學轉換，殘留的肝損傷恢復，遠期發生肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的風險降低；（3）部分治愈（partial cure），即在有限的治療療程結束后血清仍能檢測到HBsAg陽性，但持續檢測不到 HBV DNA[2，3]。

治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物主要分為兩類：（1）核苷（酸）類似物（nucleos（t）ide analogues，NAs]和（2）干擾素類（IFNs）[4，5]。失代償期肝硬化、肝衰竭、合并重要臟器功能障礙、自身免疫性疾病和心理疾病等患者禁用干擾素。在過去十年里，國內外學者為了追求更多的患者實現臨床治愈，對NAs和IFNs聯合、序貫、聯合/序貫治療進行了探索，發現治療 48周 HBsAg清除率為 14.4%，96周為20.7%[7]。新型的抗病毒藥物主要分為兩大類：①作用于乙型肝炎病毒生活周期各靶點的直接抗病毒藥物；②免疫調節劑：主要是免疫激活劑，能改善固有免疫和適應性免疫功能，從而清除病毒。

1 直接抗病毒藥物

1.1 HBV進入肝細胞抑制劑 HBV進入肝細胞主要通過黏附于硫酸乙酰肝素蛋白多糖，HBV的前S1肽段與跨膜轉運蛋白鈉-牛磺膽酸鹽共轉運多肽（NTCP）特異性結合，包膜融合，HBV核衣殼釋放至感染肝細胞的細胞質中。因此，抑制病毒進入制劑主要分為四類：中和抗體、吸附抑制劑、NTCP底物和不可逆的NTCP抑制劑[8]。其中NTCP抑制劑Myrcludes B正進行Ⅱ期臨床試驗，主要觀察該藥物聯合或不聯合Peg-IFN在乙型肝炎合并丁型肝炎共感染患者治療48周的抗病毒療效。研究結果顯示在30例聯合治療患者中有29例HDV RNA下降大于2 lg copies/ml，其中15例檢測不到病毒RNA，而在單藥治療的30例患者中僅有15例HDV RNA下降大于2 lg copies/ml，其中4例檢測不到病毒核酸。該藥對于HBsAg的下降沒有明顯影響，主要抑制HBV cccDNA在非感染的肝細胞中的合成，因此可能在預防母嬰垂直傳播或肝移植患者再感染方面更有意義[9]。

1.2 靶向作用于HBV cccDNA 包括破壞和損傷cccDNA和使cccDNA功能性沉默。研究發現IFN-α、淋巴毒素-b受體激動劑和T細胞衍生的細胞因子（即IFN-γ和TNF-α）可以非溶解方式從感染細胞的細胞核中特異性地清除cccDNA[10-12]。核胞苷脫氨酶（APOBEC3A或APOBEC3B）被招募到cccDNA，經過脫氨基作用增加cccDNA分子敏感性并使其降解。另外，分子剪刀，如鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）或者近年來發現的基于CRISPR/Cas9的基因編輯法似乎在直接靶向并減少cccDNA病毒庫方面都是潛在的工具[13，14]。在今后的試驗中，需要進一步檢測脫靶效應和細胞毒性等。在功能性沉默方面，基因組表觀遺傳修飾能阻礙cccDNA轉錄活性并關閉病毒蛋白表達。但這些作用不具有特異性，因而可能對宿主細胞造成不良反應[15]。HBV X蛋白（HBx）可通過Smc5/6限制因子降解和抑制cccDNA轉錄和復制[16]。基于以上作用機制的藥物也在臨床前研究階段。

1.3 靶向作用于病毒轉錄本 在動物模型和人體試驗，已廣泛開展RNA干擾技術抑制HBV復制研究。目前有 ARB-1467、ARB-1740、RG-6004、AROHBV和ARC-520等多種小干擾RNA（siRNA）處于臨床前或早期臨床研究中。ARB-1467是一種新型RNA干擾藥物，通過專有的脂質納米粒子（LNP）技術實現干擾。在ARB-1467與NAs聯合治療的IIa期臨床試驗中，患者對該藥物耐受性良好，并使所有受試者血清HBsAg水平降低。在11例HBeAg陰性患者（HBsAg≤1000 IU/ml），給予每兩周靜脈給藥一次，有7例（64%）在治療10周HBsAg降低≥1 lg u/L[17]。箭頭公司研制的ARC-520能沉默cccDNA表達，Ⅱ期臨床試驗結果顯示該藥在患者體內能安全耐受，在HBeAg陽性初治患者采用ARC-520治療后HBsAg、HBeAg和HBcrAg明顯，在HBeAg陰性組和HBeAg陰性NAs經治患者組HBsAg下降幅度稍低[18]。ARO-HBV主要作用于2.1 kb的S段和0.7 kb X段，能夠減少所有HBV mRNA和整合的HBV DNA的產生，納入HBeAg陽性患者11例和HBeAg陰性患者13例，每月給予ARO-HBV siRNA 1次，共給藥3次，在給藥后1 d發現HBeAg陽性患者HBsAg水平下降2.1 lg copies/ml，HBeAg陰性患者 HBsAg水平下降 1.8 lg copies/ml，而HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg均有不同程度的下降[19]。該技術有可能發生脫靶、載體帶來的毒性反應和模式識別受體引起的免疫激活效應風險,需要在今后的實驗中探索解決。

1.4 靶向作用于核衣殼的組裝和前基因組RNA的包裝 核衣殼的形成和前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA）的包裝是病毒生活周期中的關鍵步驟。因此，針對該階段進行抑制或調節在乙型肝炎治愈方面起著重要作用。HBV核心蛋白不僅涉及病毒基因組的轉運、pgRNA包裝和衣殼的組裝等，還涉及cccDNA染色質和穩定性的調節、病毒RNA的輸出和固有免疫的調節。目前，已有幾種非核苷小分子核心蛋白組裝抑制劑，主要通過加強蛋白與蛋白之前的相互作用，抑制pgRNA衣殼化[3]。JNJ-6379是美國楊森公司開發的衣殼組裝調節劑，正處于Ⅱ期臨床試驗。試驗分為安慰劑、25 mg、75 mg、150 mg和250 mg五組，每日口服給藥一次，共給藥28 d。在75 mg和150 mg組，38%患者HBV DNA低于檢測下線；在250 mg組，56%患者HBV DNA低于檢測下線。隨著劑量增加，患者對該藥的耐受性依然良好，抗病毒效果強，在大劑量下可能會破壞衣殼的形成，從而阻礙cccDNA的補充[20]。另一種衣殼抑制劑ABI-H0731在Ⅱ期臨床試驗中納入了HBeAg陽性和陰性非肝硬化患者，其中亞洲人群大于90%，口服給藥每日一次，連續給藥28 d。檢測HBV DNA水平較基線下降4.1 lg copies/ml，但該藥對于HBeAg和HBsAg水平沒有影響。停藥后出現了病毒學反彈，但沒有出現生化指標的改變[21]。另外，尚處于Ⅰb期臨床研究的藥物NVR3-778顯示出較好的抗病毒活性，患者血清HBV DNA、HBV RNA和HBsAg水平均有所下降，與Peg-IFN聯合效果更佳[22]。AB-423臨床前研究顯示對于感染動物模型有強效抗病毒活性，聯合恩替卡韋能增強抗病毒活性，后續的臨床研究正在進行中[23]。

1.5 靶向作用于HBsAg 核酸聚合物可以減少HBsAg的分泌，使外周血HBsAg水平降低，從而極大的促進宿主免疫功能的恢復，達到清除病毒的目的。臨床試驗納入REP2055單藥治療患者8例，REP2139單藥治療患者12例，另外9例短期聯合Peg-IFN或胸腺肽α-1治療，結果顯示單藥治療的兩組患者血清HBsAg下降2～7 lg u/L，HBV DNA下降3～9 lg copies/ml，并且出現了HBsAb（10～1712 mIU/ml），短期聯合治療組有8例出現了HB-sAg消失，9例患者 HBsAb滴度均持續升高[24]。REP2139聯合Peg-IFN治療乙型肝炎、丁型肝炎共感染的臨床試驗納入12例患者，患者每周接受一次REP 2139 500 mg靜脈注射，持續15周。然后，每周一次REP 2139 250 mg靜脈注射、Peg-IFNα-2a 180 μg皮下注射，聯合治療15周，接著用Peg-IFNα-2a 180μg每周一次單藥治療，持續33周。6例患者在治療結束時HBsAg水平低于50 IU/mL（均＜0.05 IU/ml），其中 5例在隨訪 1年結束時保持了這種抑制狀態。6例患者在治療結束時HB-sAb滴度超過10 mIU/ml，并有5例患者保持到隨訪1年后。9例患者在治療結束時抑制了HBV DNA（＜10 IU/ml），7例患者維持到隨訪結束時。11例患者在治療期間HDV RNA轉陰，治療結束時仍有9例患者HDV RNA陰性，其中7例患者在1年隨訪結束時仍為陰性。到1年隨訪結束時，在12例患者中有9例發生血清氨基轉移酶正常化[25]。

1.6 HBV DNA聚合酶 新一代的NAs增強了抗病毒功效，但其口服生物利用度和長期抗病毒耐受性等問題，除了替諾福韋艾拉酚胺已經上市外，CMX157、AGX-1009、Besifovir和 Lagociclovir valactate還處于臨床試驗階段[26]。此外。去年吉利德公司與Precision合作，利用能夠精確識別DNA長序列的歸巢核酸內切酶靶向作用于DNA序列，實現基因編輯效率的最大化和脫靶效應的最小化，該酶將是治愈HBV感染的另一候選分子。

2 免疫調節劑

2.1 治療性疫苗 治療性疫苗旨在誘導功能上有效的抗病毒免疫反應，克服已經建立的HBV特異性T細胞的耗竭。目前的治療性疫苗主要包括伴或不伴有強效佐劑的常規HBsAg疫苗、T細胞疫苗、HB-sAg和人類抗HBs免疫復合物、表達HBV抗原凋亡細胞、DNA疫苗和表達HBV蛋白病毒載體的疫苗[3]。酵母來源的HBsAg免疫復合物（YIC）疫苗已進入Ⅲ期臨床試驗，其在健康人群和慢性乙型肝炎患者使用的安全性在Ⅰ期和Ⅱa期臨床試驗中得到了證實[27]。YIC在雙盲、安慰劑對照的Ⅱb期試驗中顯示出對慢性乙型肝炎患者的有效性，但是在Ⅲ期臨床試驗中結果并不理想[28]。在治療組和安慰劑對照組患者病毒載量和肝功能的恢復情況結果相似[29]。另一種疫苗GS-4774是基于熱滅活的酒釀酵母表達HBsAg、HBcAg和HBxAg。在Ⅱ期臨床試驗納入178例NAs經治患者，一組繼續口服抗病毒藥物，一組分別聯合GS-4774每4周一次，用至20周，在治療24周和48周檢測HBsAg下降水平無明顯差異，5例HBeAg陽性患者接受GS-4774治療后HBeAg消失，而對照組無1例出現。3例使用GS-4774患者HBsAg下降大于0.5 lg u/L，沒有出現HBsAg消失[30]。DV-601是一種含有HBsAg和HBcAg的疫苗，其Ⅰ期臨床試驗顯示出安全性和免疫原性好，Ⅰb期納入14例慢乙型肝炎患者，采用DV-601聯合恩替卡韋抗病毒治療，8例中有2例發生了HBeAg血清學轉換，14個患者中有4例發生了HBsAg血清學轉換，各組均觀察到HBV DNA下降。在6例HBeAg陽性接受DV-601大劑量治療的患者中有2例檢測到HBc特異性IFN-γ T細胞反應，但后期臨床試驗沒有繼續開展[31，32]。HeberNasvac是含有HBsAg和HBcAg的疫苗 ，在完成對慢性乙型肝炎初治患者的Ⅲ期隨機、開放、Peg-IFN對照臨床試驗中共納入160例慢性乙型肝炎初治患者，與Peg-IFN治療相比，該疫苗更安全、能耐受，表現出持續病毒學控制和轉氨酶復常，在隨訪48周時HBeAg 血清學轉換率較高[32，33]。

2.2 干擾素類 IFN-α在慢性乙型肝炎的治療中已應用于臨床，近年來研究發現IFN-α能抑制pgRNA衣殼化，增強cccDNA降解，并在cccDNA轉錄的表觀遺傳修飾方面發揮作用。IFN-α治療HBV不同基因型療效差異巨大，今后有望從該機制入手尋找新的治療靶點[3]。

2.3 IFN基因激動劑的刺激物 IFN基因刺激物是細胞質DNA受體多重銜接蛋白和病原體識別受體識別細菌的第二信使，可能是激活固有免疫反應的潛在目標。干擾素基因激動劑的刺激劑也可以用作治療性疫苗接種的佐劑。維甲酸誘導蛋白1不僅已被證實能誘導IFN和細胞因子的產生，同時也能通過識別pgRNA結構，抑制HBV復制。SB-9200是二核苷酸SB 9000的口服前體藥物，能激活維甲酸誘導蛋白1和核苷酸結合產生含寡聚化結構域的蛋白質2，在動物模型中表現出抗HBV活性，同時能減少HBsAg的產生[3]。在臨床試驗中，對于HBV DNA和HBV RNA的抑制作用呈劑量依賴性，在HBeAg陰性患者組，給予SB-9200 100 mg治療，血清HBV DNA和HBV RNA下降明顯。在HBeAg陽性患者，血清HBV DNA和HBV RNA下降幅度均較小[34]。

2.4 病原識別受體 病原識別受體在固有免疫中發揮著重要作用。GS-9620是口服的Toll樣受體7（TLR-7）激動劑，在慢性乙型肝炎病毒感染的動物模型中能較好控制外周血和肝組織HBV DNA復制，同時HBsAg也明顯下降[3]，在使用GS-9620與TDF聯合治療的II期試驗中，血清炎性細胞因子，如IFN-γ誘導蛋白（IP-10）和IFN誘導型T細胞α化學引誘物（ITAC），以劑量依賴性方式瞬時增加。干擾素刺激基因（ISG）mRNA轉錄物水平也以類似的劑量依賴性方式被誘導。然而，盡管存在免疫刺激的證據，但在治療24周后血清HBsAg和HBV DNA沒有顯著下降[35]。

2.5 免疫檢測點的調節 在慢性HBV感染人群，缺乏T細胞介導的反應部分是由于共抑制受體的過度表達，其中程序性死亡受體1（PD-1）、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）和T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）研究較多。Nivolumab是一種針對PD-1的單克隆抗體，被批準用于治療實體器官腫瘤和淋巴瘤。它可能會逆轉慢性乙型肝炎感染的免疫功能障礙，在動物模型和人體離體研究的前期試驗中已經得到證實。Ⅰ期臨床試驗納入NAs經治HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者，靜脈給予nivolumab聯合或不聯合GS-4774，均可產生血清HBsAg的適度降低，并且耐受性良好[36]。但需警惕這種方法可能會產生不受控制的暴發性肝炎和自身免疫性疾病，導致致命性的器官損傷[3]。另一種凋亡誘導劑APG-1387是凋亡蛋白拮抗劑的二價小分子抑制劑，目前正在進行I期開發[37]。

慢性HBV感染存在選擇性免疫功能障礙，主要表現為缺乏成熟的記憶T細胞，HBV特異性T細胞的耗竭，T細胞擴增受損，細胞因子產生改變。此外，高病毒載量，持續暴露于大量的HBV抗原中可進一步使HBV特異性T細胞功能損傷[31]。要想獲得乙型肝炎治愈也許單一用藥難以實現，采取聯合治療的策略更可取。一方面要控制病毒載量，減少病毒復制引起的再感染，改善固有免疫功能；降低病毒抗原滴度，糾正免疫耐受；盡可能減少病毒復制模版cccDNA水平；另一方面，要恢復HBV特異性T細胞的反應性，增強體液和固有免疫反應，糾正免疫損傷，實現停藥后的持久免疫應答。不同靶點的聯合治療可以提高耐藥屏障，減少單藥有效劑量，從而減輕藥物不良反應。抗病毒治療聯合免疫調節劑可能是未來治愈慢性乙型肝炎的主流路線。