間充質干細胞來源的外泌體對骨關節炎的治療作用研究

肖昆林，張蕊，張維杰，馬建兵*

(1.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院，陜西 咸陽 712000；2.西安交通大學附屬紅會醫院關節外科，陜西 西安 710054)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的關節退行性病變，以軟骨丟失、軟骨下骨異常改變、滑膜炎及骨贅形成為特征，常常引起受累關節疼痛、活動受限并最終導致關節功能障礙。隨著老齡化社會的到來，OA已經成為中老年人生活質量下降和致殘的首要原因[1]。據世界衛生組織預測，我國將成為世界OA患病人數最多的國家[2]。骨關節炎嚴重威脅人類的健康和生活，給社會帶來了巨大的經濟負擔。傳統的OA治療方法，如功能鍛煉、理療、改變生活方式和使用止痛藥物等，都只能暫時緩解癥狀，而不能治療OA的發病機制或逆轉OA的進程。對于較嚴重的病例，只能采取關節置換手術治療，如截骨矯形術、關節鏡手術和關節成形術。盡管關節置換手術比較有效，但是患者的不滿意度仍高達30%，而且這種方法有一定的使用年限，使用過程中需要復雜的維護，并且這種方法不適合活動量較大的年輕患者[3-4]。因此，尋找一種新的骨關節炎治療方法一直是該領域的研究熱點之一。

1 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的特點及直接應用MSCs對OA的治療

1.1 MSCs的特點及分類 近年來，隨著對干細胞研究領域的深入，MSCs用于骨關節炎的治療引起人們越來越多的重視。MSCs可以自骨髓、脂肪組織、臍帶、外周血、滑膜及其他組織中分離得到[5]，是一類具有自我更新能力的多潛能祖細胞，可以分化成多種細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[6]。由于MSCs較容易獲得、對供體的影響小，分化能力強，不僅有助于組織修復，而且還具有免疫調節和抗炎作用，已經被廣泛用于各種疾病的治療，包括對軟骨退行性疾病OA的治療。

1.2 直接應用MSCs對OA的治療

1.2.1 治療種類 目前，直接應用MSCs對OA進行治療包括基于組織工程支架的MSCs植入術和直接將MSCs注入到受損關節的關節腔中。前者主要應用于修復受損比較嚴重的關節面軟骨組織，后者主要應用于早期OA的治療。兩種方法在OA動物模型上都取得了良好的治療效果。在臨床上也有病例報道，影像學顯示OA疾病表現得到了改善，問卷調查顯示OA患者滿意度得到了提高[7]。

1.2.2 治療優勢及存在問題 MSCs細胞由于比較容易獲得、增殖能力強，以及在一定的條件下可以定向分化為軟骨細胞和軟骨組織，在治療軟骨退行性疾病OA方面具有潛在的優勢和實際的治療效果。近年來，許多臨床前動物實驗和臨床試驗都證明，間充質干細胞療法治療軟骨損傷和OA是一種很有前景的新治療方法。但幾乎所有間充質干細胞都有其自身的局限性，如分離采集和運輸要求條件高、對供體的年齡要求較高以及體外培養增殖能力有限等，極大地限制了其臨床應用。此外，干細胞的數目和修復能力也會隨著人體正常的新陳代謝而相應地減低，最終會影響干細胞的活性以及療效。MSCs等干細胞在體外培養傳代的過程中也會不斷地衰老，從而喪失其多向分化潛能。因此，對于骨關節炎的治療，尋找一種易采集、性質穩定、免疫原性低、作用效果好的干細胞替代品以彌補以上的不足成為近幾年人們關注的焦點。隨著對干細胞研究的深入，人們發現MSCs不僅能通過自身增殖分化替代受損組織，還可以分泌一種重要的微環境調控物質—外泌體，實現對OA疾病的修復治療作用。

2 外泌體的來源及組成

生物體內除了一些特殊的細胞可以釋放一些分泌小泡，例如激素及神經遞質外，所有的細胞都可以分泌細胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)。這種分泌過程從細菌到植物和人高度保守[8]。EV最初被認為是細胞排除內部代謝廢物的一種方式，現在的研究發現EV的作用更多的是在細胞之間進行物質交換，這些交換的物質包括核酸、蛋白質和脂類物質。這些物質在細胞之間進行信號傳導，維持細胞正常的內環境穩定或者顯示細胞的病理狀態。根據來源不同，EV主要分為細胞囊泡和外泌體。細胞囊泡直徑大致在50～500 nm之間，來源于細胞膜和融合物向膜外方向分離，釋放到細胞外。外泌體直徑大致為50～150 nm，由細胞膜包裹內含物向細胞質方向內陷分離，釋放到細胞外。

外泌體是具有雙層脂膜結構的微型囊泡，來自于細胞內的多泡體(multivesicular body，MVB)，其內含有多種蛋白質、核酸及脂類等物質，核酸包括mRNA及microRNA[9]。外泌體在細胞間信息交流的過程中發揮重要作用，許多細胞類型，包括干細胞、B和T淋巴細胞、肥大細胞、樹突狀細胞、血小板和腫瘤細胞都可以分泌外泌體，人們在大多數體液如血液、尿液、腦脊液、母乳和唾液中也發現了外泌體[10]。

3 MSCs來源的外泌體及其對OA的治療

3.1 MSCs來源的外泌體 通過質譜分析和微陣列進行的詳細分析顯示MSCs外泌體攜帶有復雜的核酸(mRNA和miRNA)、蛋白質和脂質。MSCs是間質支持細胞，主要用于維持體內組織微環境以獲得最佳的組織功能，其外泌體含有豐富的細胞外基質蛋白和酶，可調節和恢復細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的穩態[9]。越來越多的研究表明，MSCs對疾病的治療效果主要是通過旁分泌的作用實現的。這主要是基于注入體內的MSCs在體內移植和停留的時間有限，MSCs以旁分泌的方式發揮了其治療作用，這種作用通過外泌體調節相應組織中的細胞而完成[11-13]。實際上，一些研究已經揭示，在一些疾病動物模型實驗中，外泌體作為潛在的治療手段促進了創傷后組織的再生和修復，包括創傷性腦損傷、肺動脈高壓、創傷愈合等[14-16]。對于OA的治療表明，MSCs外泌體可以介導軟骨的修復和再生，改善OA癥狀及延緩OA疾病的進展。

3.2 MSCs來源的外泌體對軟骨缺損的治療 Zhang等[17]首次證明了人類胚胎MSCs外泌體對軟骨組織的修復作用。該研究在12只成年SD大鼠股骨遠端的滑車溝制作骨軟骨缺損模型，然后在每只動物缺損一側的關節內注射外泌體，另一側注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)作為對照。6周和12周后外泌體處理的缺損組較PBS組在外觀和組織學評分方面都有了明顯的改善。特別是12周后，外泌體處理的缺損組表現出軟骨和軟骨下骨的完全修復，其特征包括具有規則表面的透明軟骨，完全粘附到鄰近軟骨，并且ECM沉積非常類似于年齡匹配的未處理對照組。相反，對側PBS處理的缺損組僅表現為纖維軟骨修復。該研究表明了MSCs外泌體作為軟骨再生和ECM合成的無細胞療法的效用。

3.3 MSCs來源的外泌體對OA的治療 Wang等[18]研究報道胚胎間充質干細胞(embryonic stem cell-mesenchymal stem cell，ESC-MSCs)來源的外泌體可以通過平衡軟骨ECM的合成和降解來緩解骨關節炎。研究團隊在C57BL/6J小鼠的膝關節進行內側半月板去穩定化(destabilization of the medial meniscus，DMM)及剪斷內側副韌帶手術，建立OA模型。4周后于OA模型小鼠關節內分別注射ESC-MSCs或其外泌體。8周后用組織學染色和國際骨關節炎研究協會(osteoarthritis research society international，OARSI)評分評估軟骨破壞和基質降解的程度。結果發現關節腔內注射ESC-MSCs組減輕了模型小鼠軟骨破壞和基質降解的程度，而注射外泌體組更大程度提高了Ⅱ型膠原酶(Col Ⅱ)和降低了基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)13的表達。此研究表明ESC-MSCs來源的外泌體通過平衡軟骨細胞外基質的合成和降解，對OA產生了良好的治療作用，從而為OA的治療藥物及給藥系統的開發提供了實驗依據。

Tao等[19]的研究發現，miR-140-5p過表達的滑膜間充質干細胞(synovium-derived mesenchymal stem cell，SMSC)來源的外泌體(SMSC-140-Exo)可增強軟骨組織再生。他們用含或不含miR-140-5p轉染SMSC，分離并鑒定由SMSC或SMSC-140s(SMSC-Exos或SMSC-140-Exos)衍生的外泌體。通過切斷內側副韌帶和內側半月板的方法建立SD大鼠OA模型，隨機分為四組，術后第5～8周每周1次進行關節腔注射。正常組(未手術組)關節腔內注射生理鹽水，接受手術的OA組大鼠分別注射生理鹽水、OA+SMSC-Exos及OA+SMSC-140-Exos組大鼠關節腔內注射SMSC-140-Exos。手術12周后收集膝關節標本評估疾病的進展。實驗結果顯示SMSC-140-Exos在預防OA方面具有良好的效果和巨大的應用潛力。

Cosenza等[20]在Ⅱ型膠原酶誘導的OA(collagenase-induced OA，CIOA)小鼠模型中發現，骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)、BMSC來源的細胞囊泡及BMSC來源的外泌體均降低了關節軟骨的損傷，對軟骨起到了保護作用。Zhu等[21]比較了關節腔注射滑膜間充質干細胞來源的外泌體(SMSC-Exos)及誘導型間充質干細胞(induced mesenchymal stem cell，iMSC)來源的外泌體(iMSC-Exos)對C57B/L10小鼠CIOA模型的作用，發現誘導型間充質干細胞來源的外泌體具有更好的治療效果。越來越多的研究表明，外泌體在介導組織修復中起著主導作用。

最近，Lopez-Verrilli等[22]的研究報道，經血來源的外泌體和骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)來源的外泌體作用相似，均能促進背根神經節神經元中神經突起的生長，但經血來源的外泌體促進皮質神經元神經突起的生長作用優于BMSC來源的外泌體的作用。但不同組織來源的外泌體對OA的作用是否存在差異，目前尚未見文獻報道。目前的研究均顯示MSCs來源的外泌體對OA具有良好的治療作用。MSCs外泌體為開發用于治療軟骨損傷和OA的即用型和無細胞療法提供了新的視角。

4 MSCs來源的外泌體對OA的治療機制

關節軟骨損傷以后，包括白介素(interleuki，IL)-1β、IL-6和IL-8在內的促炎性細胞因子和MMP-3快速上調，并導致了隨后的軟骨基質降解和關節損傷[23]。這些促炎細胞因子和MMPs主要由滑膜和巨噬細胞等免疫細胞產生，并促進了OA的發生和發展[24]。MSCs外泌體蛋白質組具有200多個免疫調節蛋白，是多因子協同作用的理想載體[9]。在IL-1β處理的原代軟骨細胞中，加入ESC-MSCs外泌體，細胞免疫組織化學結果顯示，ColⅡ表達量顯著升高而聚蛋白多糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)5表達量顯著降低。體內結果同樣表明，MSCs外泌體促進了軟骨ECM的合成，抑制了其分解代謝[18]。SMSC和iMSC來源的外泌體均促進了軟骨細胞的增殖和遷移，而后者具有更強的作用[21]。脂肪組織來源的間充質干細胞外泌體在OA患者成骨細胞中，通過降低炎癥和氧化應激反應，增強了成骨細胞的抗衰老作用[25]。

以往的研究表明，microRNA(miRNA)在OA的發生和發展中起到了重要的作用。MSCs外泌體攜帶有大量的miRNAs，有研究表明這些miRNA參與疾病相關信號轉導通路，是MSCs外泌體應對組織損傷和修復的有效調節因子[26]。例如，miR-92a通過靶向調節noggin蛋白經PI3K/AKT/mTOR通路促進軟骨細胞增殖和ECM合成，從而緩解OA癥狀[27-28]。Matsukawa等[29]報道，miR-125b在調節軟骨細胞ADAMTS-4的表達中發揮著重要的作用。Meng等[30]研究表明miR-320通過直接作用于靶基因MMP-13來調節軟骨的形成。

此外，也有研究報道外泌體內的蛋白成分也發揮了積極作用，已被識別的外泌體蛋白包括：4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、脂質相關蛋白和磷脂酶以及與外泌體來源相關的細胞特異性蛋白。這些蛋白在幫助外泌體進出細胞的過程中發揮著重要作用，同時因為這些蛋白的保守性也被用來當作表面標記物來鑒定體外分離得到的外泌體[31]。更多的研究將進一步深入揭示MSCs外泌體在不同的條件下組成成分的變化及其對OA的治療作用機制。

5 MSCs來源的外泌體對OA治療的應用前景

MSCs來源的外泌體對OA的治療在臨床上還很少見，還存在一些問題需要解決。在臨床研究中，應進一步探索MSCs來源的外泌體在體外培養的最佳條件和體內治療的確切機制。不過，由于外泌體具有獨特的優越性，使其在對疾病治療中表現了強大的潛在優勢。由于外泌體的形成要在細胞內經過多次的包裝，因此外泌體具有生理生化穩定性，而MSCs來源的外泌體可做為一種再生藥物用于疾病的治療。外泌體具有特定的結構和大小，有著特定的分子標記，在實驗室中通過選擇細胞來源和改變培養條件很容易獲得特定的外泌體。另外由于外泌體與靶細胞獨特的親和性，使得外泌體成為裝載和運輸特定蛋白、miRNAs等的理想工具。隨著對外泌體研究的不斷深入，外泌體對骨科疾病的治療已經引起了越來越多學者的廣泛關注。目前已有許多研究報道MSCs來源的外泌體可以修復受損的組織或細胞，并且MSCs來源的外泌體表現出對OA的治療作用。在動物模型研究中將進一步探索和驗證MSCs來源的外泌體的治療功效、生物安全性、動力學和生物分布等問題。另外，外泌體的規范化抽提，使用外泌體治療的規范化用量及療程等問題，都有待于長期的、大量的實驗研究進行進一步探索和驗證。這些問題的解決將推動MSCs來源的外泌體應用于臨床治療。如果外泌體可以用特定的生物制劑和某些產品進行包裝生產，那么它們將可以大規模應用于臨床。未來，MSCs外泌體相關療法將可能成為臨床上治療OA的常規再生藥物。

6 結 論

總之，MSCs外泌體是目前廣為接受的治療疾病的再生藥物，足以介導MSCs對疾病的治療功效。通過選擇細胞的來源或通過基因工程操作可以將需要的外泌體進行體外擴大再生產，從而大規模應用于臨床。在治療OA方面，MSCs外泌體可能是比MSCs細胞療法更安全、更方便和更有效的治療方式。

目前，外泌體在醫學領域的研究才剛剛起步，許多功能及其作用機制尚未完全闡明，尤其外泌體在骨關節炎方面的應用研究還相對較少。隨著外泌體在組織修復與再生、疾病診斷、靶向藥物治療、免疫治療等方面研究的不斷深入及研究手段的不斷更新，相信MSCs外泌體對骨關節炎的治療將會取得更滿意的效果，得到更廣泛的應用。