柚皮苷和柚皮素對HepaRG細胞核受體蛋白表達的影響

樊威洋，吳灝，王永剛，蘇薇薇，何鄉，李沛波

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

核受體是一種配體依賴性結合后激活的轉錄因子，屬于生物體內轉錄因子超家族成員之一。核受體能被特異性的配體激活或抑制，參與細胞內轉錄水平調控，在信號轉導、細胞分化、細胞凋亡、細胞代謝和細胞內環境穩定等多種生理過程調控中發揮著重要的作用[1]。肝臟中核受體表達與肝臟疾病密切相關，核受體及其轉錄協同因子本身或受其調控的靶基因表達的紊亂是導致肝臟代謝失衡及肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝纖維化和肝癌等肝臟疾病發病的重要因素之一[2]。芳香烴受體(AhR)、孕烷X受體(PXR)、組成型雄甾烷受體(CAR)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)參與肝臟中多種內源性和外源性物質轉運、代謝和清除[3]。有文獻表明，AhR基因敲除小鼠會出現肝重量降低、短暫的肝臟微血管脂肪變等發育異常[4]以及肝血管過度增殖[5]等現象；AhR也被認為是包括癌癥在內的多種疾病的藥物靶標[6]。PXR可通過蛋白磷酸化機制，影響肝癌細胞的形態和遷移能力[7]。CAR的激活能使脂質分解物質代謝基因(CPT1A、HMG-CoA)表達降低，而使脂質合成基因(SCD1)表達增高，從而引發非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)[8-9]。PPARα可通過上調肝脂肪酸結合蛋白的轉錄表達來增加高密度脂蛋白，并降低血清甘油三酯和低密度脂蛋白，也參與介導的線粒體脂肪酸氧化誘導[10]。

柚皮苷(naringin)是一種二氫黃酮糖苷，由苷元柚皮素(naringenin)在C-7處結合新橙皮糖所形成，主要存在于蕓香科柑橘屬水果的果皮和果肉中，亦是中藥枳實、枳殼、化橘紅的主要有效成分之一，柚皮苷進入體內后，小部分可以被小腸直接吸收入血，大部分由腸道微生物水解為柚皮素，繼而經腸道吸收入血[11]。文獻表明，柚皮苷和柚皮素既能調節肝臟代謝平衡，降低肝臟氧化損傷，也具有抗肝炎、抑制肝癌細胞增殖遷移、抗肝纖維化等作用[12-13]。然而，柚皮苷、柚皮素對肝臟中核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達的影響尚未見文獻報道。本實驗采用免疫印跡法，考察柚皮苷、柚皮素對人肝癌細胞HepaRG中AhR、PXR、CAR和PPARα 4種核受體蛋白表達的影響，為研究柚皮苷、柚皮素防治肝臟疾病的機制提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株 人肝癌HepaRG細胞株，購自上海冠導生物工程有限公司。

1.2 主要藥物與試劑 柚皮苷、柚皮素和DMSO(純度>98%，德國Sigma-Aldrich公司)；利福平(Rifampicin，純度>98%，上海Aladdin公司)；RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海Beyotime公司)； HRP偶連抗兔二抗(美國Promega公司)； Anti-AhR抗體(ab190797)、Anti-PXR抗體(ab85451)、Anti-CAR抗體(ab62590)、Anti-PPARα抗體(ab24509)和重組Anti-GAPDH抗體(ab181602)均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器 HERAcell VIOS 160i型CO2細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司)；Arium mini超純水系統(德國Sartorius公司)；多孔超微量核酸蛋白分析儀Epoch(美國Biotek公司)；通用電泳電源、小型垂直電泳槽、Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白轉印儀(美國Bio-rad公司)；Tanon 5200天能化學發光成像系統(中國Tanon公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 用完全RPMI-1640培養基(內含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)在37 ℃、5% CO2培養箱中常規貼壁培養人肝癌HepaRG細胞，每隔2 d對細胞換液，細胞生長占據培養底面積80%以上時使用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 藥物配制與細胞處理 稱取柚皮苷、柚皮素和利福平，以DMSO溶解并用0.22 μm濾頭過濾除菌，配置成終濃度為10、30和100 mmol·L-1的柚皮苷、柚皮素母液和50 mmol·L-1的利福平母液。

取對數生長期的HepaRG細胞，均勻接種于六孔板中培養過夜，分別以含不同濃度柚皮苷(10、30、100 μmol·L-1)、柚皮素(10、30、100 μmol·L-1)或利福平(50 μmol·L-1)的培養基處理24 h或48 h。

2.3 總蛋白提取 藥物處理結束，使用RIPA裂解液裂解HepaRG細胞15 min，劇烈渦旋振蕩5 min后，于4 ℃條件下以12 000 rcf離心20 min，棄去底部細胞碎片沉淀，收集上清即為HepaRG細胞總蛋白。

2.4 蛋白免疫印跡法

2.4.1 蛋白樣品制備和SDS-PAGE凝膠配置 采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定HepaRG細胞總蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和PBS稀釋總蛋白至1 μg·μL-1，煮沸10 min，上樣。

2.4.2 蛋白上樣電泳和轉膜 每孔的總蛋白上樣量為20 μg，80 V恒壓電泳10 min后轉為250 V恒壓電泳25 min。甲醇浸泡活化0.2 μm PVDF膜后，用半干轉轉膜液浸泡平衡濾紙和PVDF膜30 min，使用Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白轉印儀2.5 A恒流半干轉17 min。

2.4.3 封閉、抗體孵育與檢測 轉膜結束后用TBST洗膜3次，每次5 min；用5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h；再用TBST洗膜3次，每次15 min；加入含有對應一抗的孵育液，于4 ℃孵育過夜，取膜用TBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗孵育液，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次15 min。以ECL高敏發光液孵育10 s，使用Tanon 5200天能化學發光成像系統檢測。

3 結果

柚皮苷、柚皮素對人肝癌HepaRG細胞中AhR、PXR、CAR和PPARα這4種核受體蛋白水平的影響結果見圖1～4。由圖1～2可見，柚皮苷、柚皮素處理人肝癌HepaRG細胞24 h后，與空白組相比，100 μmol·L-1柚皮素顯著抑制AhR和PXR蛋白的表達，但對CAR、PPARα蛋白表達沒有影響；50 μmol·L-1利福平顯著抑制AhR蛋白表達、促進CAR蛋白表達，但對PXR、PPARα蛋白表達沒有影響；其余給藥處理組的AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達在統計學意義上沒有顯著性差異。由圖3、4可見，柚皮苷、柚皮素給藥處理人肝癌HepaRG細胞48 h后，與空白組相比，100 μmol·L-1柚皮素顯著抑制核受體AhR和PXR的蛋白表達，但對CAR和PPARα蛋白表達沒有影響；50 μmol·L-1利福平顯著抑制核受體AhR蛋白的表達，對CAR、PXR、PPARα蛋白表達沒有影響；其余給藥組的AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達在統計學意義上沒有顯著性差異。

圖1 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞24 h后核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達的Western blotting結果

圖2 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞24 h對核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白相對表達量的比較(n=6)

圖3 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞48 h后核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達的Western blotting結果

圖4 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞48 h后核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白相對表達量的比較(n=6)

4 討論

AhR作為一種與肝臟疾病密切相關的蛋白，參與生長因子信號傳導、凋亡基因表達、細胞周期和細胞因子表達的調控[14-15]，可影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程[16]。臨床研究表明，AhR在肝癌組織中有高表達現象，而且與癌癥的惡性程度相關[17]，抑制AhR表達可能有利于肝癌的防治。PXR可調控多種藥物代謝酶和轉運體的表達，進而參與肝臟中脂質、糖類物質和臨床藥物的代謝，影響肝臟疾病的發生發展進程[18]，大多數肝臟疾病中均可見PXR在肝細胞中表達和活性的上調[19-20]。過量服用對乙酰氨基酚(APAP)會激活PXR，靶向調節藥物代謝酶CYP450家族的表達，引起APAP藥物代謝過程中有毒代謝物N-乙酰對苯醌亞胺的大量積累，進而誘導氧化應激、DNA損傷和線粒體功能受損[21]。此外，利福平與異煙肼合用時，通過激活PXR來促進氨基乙酰丙酸合成酶Ⅰ的表達，增加膽汁中血紅素前體原卟啉Ⅸ的產生，從而造成肝損傷[22]。因此，抑制PXR表達在肝臟疾病藥物篩選與治療中具有潛在價值。

Zhou等[23]研究表明，柚皮苷能通過減輕脂質積累、減少氧化應激和凋亡來抑制酒精誘導的斑馬魚肝損傷和脂肪變性。Arul等[24]研究表明，柚皮素能抑制N-亞硝基二乙胺誘導大鼠肝癌的發生和前期病變。Ahmed等[25]研究表明，柚皮苷和柚皮素能顯著改善APAP引起的肝組織細胞質空泡化和炎性細胞浸潤，具有增強抗氧化防御并抑制炎癥和細胞凋亡的作用。

本實驗結果表明，100 μmol·L-1柚皮素能顯著下調HepaRG細胞AhR、PXR的蛋白表達，提示柚皮素可能可以通過抑制AhR和PXR的表達來發揮抗肝癌和肝損傷的作用。但是，在本實驗中，柚皮苷對AhR、PXR、CAR和PPARα這4種核受體蛋白均無顯著性影響，可能是因為柚皮苷極性較大而無法通過HepaRG細胞膜。本研究從核受體方面為柚皮苷、柚皮素防治肝臟疾病提供了一定的藥理學依據。