柴胡屬藥用植物多重實時熒光PCR檢測方法的建立

張全芳，范陽陽，劉艷艷，陳雪燕，譚晴晴，胡悅，劉國霞，汪冰，林永強*，步迅*

(1.山東省農業科學院生物技術研究中心，山東省農業科學院應用生命科學實驗室，山東 濟南 250100；2.山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局膠類產品質量評價重點實驗室，山東 濟南 250101)

柴胡，是傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(BupleurumL.)植物的干燥根，始載于《神農本草經》，原名茈胡，列為上品。至《本草圖經》始易其名為柴胡[1]。具有解表和里、疏肝解郁、升舉陽氣之功效，為中醫治療少陽癥的首選要藥[2]。《中國藥典》2015年版規定柴胡來源于柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)，分別習稱為北柴胡和南柴胡。藥用柴胡植物主要是來自25種、8個變種、3個變型的傘形科(Belliferae)芹亞科(Apioideae)柴胡屬(Bupleurum)的植物[3-4]。柴胡在我國有著兩千多年藥用歷史，是最常用的大宗藥材之一，但柴胡屬植物眾多，分布廣泛，在產地均作藥用，導致柴胡藥材品種混雜，藥材質量極不穩定[5]。常見的混偽品如黑柴胡(BupleurumsmittiWolff.)、銀州柴胡(BupleurumyinchwensenShan et Y Li)、柴首(BulpeurumchaishouiShan et Sheh)、大葉柴胡(BupleurumlongiradiatumTurcz.)、秦嶺柴胡(BupleurumlongicauleWall wx DC.Var.Giraldii Wolff.)[6]。

目前，柴胡的鑒定主要依靠形態學特征或其中的化學成分柴胡皂苷a、d加以區分，但是由于柴胡屬植物在形態、組織上差別不大，且受產地、生態環境、采收時間、加工方法等諸多可變因素的影響，同一種柴胡的生藥鑒別特征也會變化，更增加了鑒別的難度[7]。僅用性狀、顯微及理化鑒別方法較難準確的區分市場上的柴胡品種，因此，建立更加可靠的柴胡鑒別方法對于保證柴胡藥材的質量及用藥安全具有重要意義。

隨著分子生物學技術的發展，一些基于DNA的生物學鑒定手段逐漸豐富起來，與傳統分析方法相比，DNA分子法更加客觀和準確。目前柴胡鑒別的分子手段主要是DNA條形碼技術，通過DNA測序手段比較柴胡的ITS序列進行鑒別操作復雜，儀器配套成本高，局限性大。近年來實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)技術的飛速發展大大提高了檢測的靈敏度、特異性和準確性，并使得成分含量的定量溯源成為可能[8]，因此，本研究基于ITS2序列建立的南柴胡、北柴胡及偽品柴胡多重實時熒光定量PCR檢測體系將能更加準確、靈敏和快速地檢測對應源性成分。

1 材料與方法

1.1 供試材料 北柴胡、南柴胡、竹葉柴胡標準品購自中國食品藥品檢定研究院；銀州柴胡、小葉黑柴胡、錐葉柴胡、膜緣柴胡、藏柴胡、窄竹葉柴胡、白術、人參、黨參、生地、石斛、山藥、雞血藤、川貝、枸杞等中藥來自山東省食品藥品檢驗研究院。

1.2 試劑與儀器 植物DNA提取試劑盒DNA分子量Marker DL2000、電泳上樣緩沖液等PCR反應試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。引物與探針由生工生物工程(上海)有限公司負責合成。2×TaqMan Master Mix為DBI Bioscience品牌。 DNA測序由山東省農業科學院生物技術研究中心測序中心完成。

ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司)；Takara PCR儀[寶生物工程(大連)有限公司]；5424 D型高速離心機(Eppendorf公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針的設計 ITS2 序列是介于5.8S和28S rRNA 基因之間的非編碼序列，因其在核糖體rDNA 整體結構功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有較高的可變性，其序列在不同種類、或同種的不同個體中都可能存在較大差異，因此，利用ITS2 序列作為南、北柴胡鑒定靶基因具有既簡明又可靠的特性。通過比對南、北柴胡ITS2序列特征，設計南、北柴胡的特異性引物和探針，以及柴胡的通用引物及通用探針(見表1)。

表1 引物與探針序列

1.3.2 柴胡干根DNA的提取 用無菌手術刀切片刮棄表皮，剪碎混合，取80 mg置于滅菌研缽中，液氮快速研磨。采用CTAB[9]法提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量。

1.3.3 單重熒光PCR檢測方法的建立 通過對單一熒光定量PCR反應體系中的Taq酶用量、引物濃度、探針濃度和退火溫度的優化，建立了南柴胡、北柴胡的單重熒光定量PCR方法。其中上下游引物以1.0、2.0、5.0、10.0 μmol·L-1為濃度梯度，探針濃度在0.1～5.0 μmol·L-1之間，以1.0 μmol·L-1梯度遞增，每個濃度梯度做5個平行樣，PCR反應條件：95 ℃ 2 min預變性；95 ℃ 10 s，58 ℃ 35 s(收集熒光信號)，40個循環。在體系中引物和探針濃度優化后將退火溫度設置為56～66 ℃,以2 ℃為一個梯度，共6個退火溫度進行實時熒光定量PCR擴增，同一模板5個平行樣的3次重復試驗，對擴增所得數據進行分析，除了以產生Ct值最小、熒光信號強度最高和Ct值標準偏差最小綜合指數最高為依據外，還要考慮既保證擴增效率的同時又要確保探針的特異性等條件，最終確立最佳的退火溫度。

1.3.4 多重熒光PCR檢測方法的建立 在單一熒光PCR建立的最優體系和確保試驗特異性及穩定性的基礎上，在同一反應體系中加入南柴胡、北柴胡通用引物和特異探針與柴胡通用引物與通用探針，并根據閾值(即Ct值)和熒光增量，對各引物、探針濃度及循環參數進行優化，確定多重實時熒光PCR檢測體系和方法。

1.3.5 多重實時熒光PCR特異性試驗 分別從北柴胡、南柴胡、銀州柴胡、小葉黑柴胡、錐葉柴胡、竹葉柴胡、膜緣柴胡、藏柴胡、窄竹葉柴胡、白術、人參、黨參、生地、石斛、山藥、雞血藤、川貝、枸杞等植物的藥用部位提取基因組DNA為模板，按照上述優化的反應體系和反應條件進行熒光定量PCR，檢測引物和探針的特異性。

1.3.6 多重實時熒光PCR靈敏度試驗 將南、北柴胡的基因組DNA定量到50 ng，按5×梯度稀釋，每個梯度均取2.0 μL為模板量，(即：10、2、0.4、0.08、0.016 ng)，將每組檢測設立3個平行樣，每個樣品重復3次，每次試驗的結果一致才能確定該方法的檢測限靈敏度。

1.3.7 實際樣品檢測 利用建立的多重實時熒光PCR檢測方法對質檢局提供的46份柴胡樣品進行柴胡成分檢測，并與DNA測序法進行比對，以驗證方法的使用價值。

2 結果

2.1 單重熒光PCR檢測方法的建立 最佳反應體系為20 μL，2×TaqmanMaster mix 10.0 μL，對引物濃度、探針濃度和退火溫度的優化。確定最佳引物濃度為10.0 μmol·L-1，南柴胡探針終濃度為5.0 μmol·L-1，北柴胡探針終濃度為0.4 μmol·L-1，通用探針終濃度為2.0 μmol·L-1。

2.2 多重熒光PCR檢測方法的建立 通過優化引物濃度和探針濃度，確定最佳引物混合物終濃度為10.0 μmol·L-1，探針混合物終濃度為5.0 μmol·L-1，總反應體系為20 μL，包括2×TaqmanMaster mix 10.0 μL，Primer Mix(10.0 μmol·L-1)1.0 μL，Probe Mix(5.0 μmol·L-1)1.0 μL，DNA Template(1～20 ng·μL-1)2.0 μL，ddH2O 6.0 μL(見表2)。PCR反應最佳反應條件為：95 ℃ 2 min；{95 ℃10 s；65 ℃35 s} 40個循環，在此收集信號。

表2 南柴胡、北柴胡引物及探針特異性試驗

注：N 代表Negative，陰性

2.3 多重熒光PCR特異性試驗 按照“1.3.7”項下的方法針對南柴胡與北柴胡的引物和探針進行特異性檢測，當FAM、ROX熒光修飾探針有擴增曲線時，且滿足Ct≤35說明待檢樣本檢出北柴胡成分(見圖1A);當JOE、ROX熒光修飾探針有擴增曲線，且滿足Ct≤35說明待檢樣本檢出南柴胡成分(見圖1B)；當只有ROX熒光修飾探針有擴增曲線，且滿足Ct≤35說明待檢樣本為偽品柴胡(見圖1C)。另外，通過表2可以看出北柴胡和南柴胡源性成分均獲得擴增曲線且Ct值，而其他樣本沒有擴增。綜上表明，北柴胡和南柴胡的引物和探針具有很好的物種特異性。

2.4 多重熒光PCR靈敏度試驗 分析結果顯示：當南柴胡模板量為0.08 ng時，有擴增曲線且Ct值<35,當模板量為0.016 ng時，有擴增曲線但Ct值>35；當北柴胡模板量為0.08 ng時，有擴增曲線且Ct值<35，當模板量為0.016 ng時，無擴增曲線；因此，南、北柴胡的定量檢測限為0.08 ng(見圖2)。

圖1 南、北柴胡特異性擴增曲線圖

圖2 南柴胡、北柴胡靈敏度擴增曲線圖

2.5 實際樣品檢測 利用本試驗建立的方法檢測46份柴胡樣品。其中17份檢出北柴胡源性成分，5份為南柴胡，其他樣品均檢測為偽品柴胡。與DNA測序法結果一致，表明本方法具有一定的使用價值。

3 討論

目前用DNA分子標記鑒定柴胡大部分是通過提取柴胡幼嫩組織，而柴胡入藥部分多為含有大量次生代謝產物的莖或干根，并且經過進一步加工和炮制，這就為柴胡DNA的提取帶來了困難。此外，在實際應用方面多數研究也沒有獲得柴胡特有的分子標記。因此，傳統的鑒別方法不能滿足當前市場對柴胡真偽鑒定的需求，而通過改進的柴胡基因組提取方法以及實時熒光定量PCR的特異性檢測能很好地解決這類問題。王亞丹等[10-12]發現，基于ITS2序列可以準確可靠地鑒別柴胡藥材及其混偽品。本研究通過比較南、北柴胡的ITS2序列，設計并篩選得到特異PCR引物和TaqMan探針，通過優化體系和條件，建立了南、北柴胡多重實時熒光PCR檢測體系，能夠快速鑒定柴胡及其制品中南柴胡、北柴胡源性成分。在柴胡生產加工質量監控及監管部門監管中具有很高的應用價值。