清胰顆粒特征圖譜及穩定性研究

歐水平，鄭小翠，王森,3，陳靈 ，王玉和，任麗

(1.遵義醫科大學附屬醫院藥劑科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫科大學藥學院，貴州 遵義 563000；3.畢節市第一人民醫院藥學實驗室，貴州 畢節 551700)

清胰湯為遵義醫科大學附屬醫院臨床經驗方，現已記載于《古今名方》，由大黃、赤芍、梔子、木香、厚樸、醋元胡、丹皮及芒硝8味藥材組成，具有疏肝利膽、清熱瀉火、止痛通便的功效[1]。臨床應用已有五十多年的悠久歷史，療效確切，能顯著提高急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)及重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的治愈率[2-3]，具有抑制胰酶活性、降低血清淀粉酶、清除腸道內毒素等作用[4-6]。臨床長期以湯劑給藥，雖然湯劑與中醫辨證診治、隨癥加減的原則一致，但湯劑體積大，易腐壞，攜帶不便，關鍵是質量難以控制。制備成顆粒劑既保持了湯劑吸收快、作用迅速的優點，又克服了湯劑的各種缺點[7]。故本文在前期研究總結的基礎上[1]，建立清胰顆粒的特征圖譜，進而根據《中國藥典》2015年版(四部)[8]通則“0104”項下有關規定，建立清胰顆粒的質量標準，再按照通則“9001”項下相關要求，對清胰顆粒進行加速和長期穩定性試驗，為清胰顆粒的生產及質量控制提高參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Sartorius BT125D 分析天平(Sartorius 科學儀器有限公司)；TD5M低速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；DL-820D超聲儀(上海之信儀器有限公司)；DURA12型超純水機(澤拉布儀器科技有限公司)。

1.2 試藥 大黃素、大黃酸、丹皮酚(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110756-201512、110757-201607、110708-201407，純度均>99%)；延胡索對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號為120928-201609)；梔子苷、芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、延胡索乙素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-17020401，MUST-16041901，MUST-17031102，MUST-17020205，MUST-16050705，MUST-16041601，MUST-17022720，MUST-17030605，MUST-17030603，MUST-17030622，純度均>99%)；甲醇、乙腈(色譜純，瑞典Oceanpak公司)；清胰顆粒(自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 清胰顆粒制備 稱取處方量各藥材，加入10倍量65 ℃ 水浸泡30 min(除芒硝外)，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液[4]，取適量溶解芒硝，55 ℃ 減壓濃縮至稠浸膏，70 ℃ 減壓干燥，干浸膏粉碎過80目篩，即得清胰浸膏粉。稱取浸膏粉與輔料，按一定比例混勻，加入一定量濃度的乙醇，制得適宜軟材，擠壓過篩制粒，干燥0.5 h，過1號與4號篩整粒即得。空白顆粒的制備方法同清胰顆粒，但不加入清胰浸膏粉。

2.2 清胰顆粒特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 UItimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，洗脫程序：0～13 min，15%→28% B；13～15 min，28%→47% B；15～55 min，47%→56% B；55～60 min，56%→80% B；60～65 min，80%→80% B；柱溫：30℃ ；流速：1 mL·min-1，檢測波長：237 nm，進樣量10 μL。

2.2.2 溶液配制 分別精密稱取各對照品適量，制得梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯的含量依次為94.63、45.56、46.57、6.92、23.53、19.30、7.54、10.58、30.93、30.99、18.41、18.52 μg·mL-1的混合對照品溶液。精密稱定清胰顆粒0.5 g，加5 mL甲醇，超聲(400 W)30 min。過0.22 μm 濾膜即得供試品溶液，同法制得空白顆粒溶液。

2.2.3 專屬性考察 分別取空白顆粒、混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，得色譜圖(見圖1)，輔料對各成分測定無干擾，且分離度良好，此方法專屬性良好。

A.空白顆粒；B.混合對照品；C.清胰顆粒 1.梔子苷；2.芍藥苷；3.丹皮酚；4.蘆薈大黃素；5.大黃酸；6.大黃素；7.和厚樸酚；8.木香烴內酯；9.去氫木香烴內酯；10.厚樸酚；11.大黃酚；12.大黃素甲醚

2.2.4 精密度試驗 取同一供試品溶液，在色譜條件下連續進樣6次，記錄并計算得各成分峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 取同一批號清胰顆粒6份，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按色譜條件進樣測定，記錄并計算得共有峰峰面積比值的RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于進樣環境下0、2、4、8、15、24 h進行測定，記錄并計算得峰面積RSD均小于3%，表明各成分進樣環境下24 h內穩定。

2.2.7 樣品特征圖譜測定 按供試品溶液制備方法制備3批清胰顆粒溶液，取混合對照品和供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖。使用國家藥典委員會的 “中國指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，評價3批清胰顆粒的 HPLC 圖譜，通過保留時間和紫外吸收光譜圖比對，確認12個已知成分共有峰(見圖2)。以3批樣品0個月的指紋圖譜生成參照圖譜，參照圖譜與3批樣品的圖譜相似度均大于0.999，表明各批樣品與對照指紋圖譜有良好的相似性。

圖2 清胰顆粒特征圖譜(0.混合對照品；1～3.從下往上代表3批清胰顆粒在加速試驗0、1、3月的圖譜)

2.3 清胰顆粒的穩定性研究

2.3.1 加速試驗 取清胰顆粒3批樣品，在相對濕度75%±5%，(40±2)℃條件下放置6個月，分別于 0、1、2、3、6 月定期取樣測定，對其性狀、TLC定性鑒別、粒度、水分、溶化性、特征圖譜、含量測定(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)項目進行考察，含量測定的色譜條件同“2.2.1”項下。方法學結果表明：溶劑、輔料及其他藥味對蒽醌類成分測定無干擾，各成分分離度良好，專屬性良好；5個成分均在2.5～40.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好；精密度及重復性試驗所得的5個成分含量的RSD均小于3%；穩定性試驗結果表明供試品溶液室溫條件下24 h內穩定；加樣回收率試驗結果表明蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為100.42%、97.82%、97.54%、98.03%、99.95%，RSD為 2.55%、1.73%、1.49%、2.15%、1.47%。加速穩定性試驗結果見表1，在6個月加速試驗期，清胰顆粒的各項指標均符合規定。

表1 清胰顆粒加速穩定性試驗結果

2.3.2 長期試驗 將清胰顆粒3批樣品，在相對濕度60%±10%，(25±2)℃條件下放置12個月，分別于0、3、6 、9、12月定期取樣測定，對其性狀、TLC定性鑒別、粒度、水分、溶化性、特征圖譜、含量測定項目進行考察。見表2，結果表明，在12個月時間內，清胰顆粒的性狀、粒度、含量測定等指標均符合規定。

表2 清胰顆粒長期穩定性試驗結果

3 結論與討論

本文建立了清胰顆粒的特征圖譜，按《中國藥典》2015年版規定，對清胰顆粒外觀性狀、水分、粒度等進行檢查。采用TLC鑒別了本品中延胡索乙素，方法簡單快速，可作為本品的專屬鑒別。清胰顆粒所含成分復雜，包括梔子苷、木香烴內酯、芍藥苷、丹皮酚、延胡索乙素、蒽醌類及厚樸酚等成分，其中大黃作為君藥，其蒽醌類最為重要，文獻報道具有較好抗炎作用，因此，采用HPLC方法，對顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進行含量測定。建立清胰顆粒特征圖譜測定方法，其特征圖譜中測出與對照品溶液中的12個(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、去氫木香烴內酯、木香烴內酯、和厚樸酚及厚樸酚)主要特征峰保留時間相對應的色譜峰。含量測定和特征圖譜方法簡便、穩定、準確，有利于很好的控制本品質量。

本文進行初步穩定性研究，在加速試驗和長期試驗條件下，分別放置6個月和12個月，與0月相比，其性狀、水分、粒度、溶化性檢查、TLC鑒別、特征圖譜、含量測定等均符合規定，表明藥物是穩定可控的。由于時間關系，只做了12個月的長期穩定性試驗，后期將留樣繼續進行18個月或更長時間的長期穩定性考察，以此觀察有效期，為清胰顆粒的生產及臨床應用提供科學依據。