白腐菌產胞外具有酚氧化酶活性的小分子物質普遍性的研究

閆文超 黃峰

摘 要：用分子層析的方法，對19株木腐真菌在特定的培養基中生長繁殖后所得的胞外培養液進行了分離及漆酶和PO activity 測定。發現，胞外具有酚氧化酶活性的小分子物質在所有產漆酶的白腐菌中具有普遍性，推測這種小分子物質在木質素生物降解過程中發揮著一定的作用。

關鍵詞：白腐菌，漆酶，酚氧化酶活性，小分子物質

對木纖物質表面結構研究顯示，目前發現的主要木質素降解酶如木質素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（laccase）等酶分子尺寸均大于木纖物質表面微孔孔徑，因而難以滲透并與內部木質素接觸[1-2]。單獨的大分子酶類不能構成完整的木質素降解系統，必須有一些小分子活性物質的參與才能完成對木質素的自然降解過程。將培養液用膜過濾以除去菌絲，發現濾液能使硫酸鹽漿脫除木質素[3]，表明真菌與纖維的接觸不是必須的，真菌在生長過程中產生的氧化酶類和其它物質共同導致了一個緩慢的、連續的木質素降解過程。

作者通過對一株白腐菌的研究發現，白腐菌在生長過程中，會產生一種小分子物質。這種小分子物質，除能產生羥自由基，能絡合鐵，能還原三價鐵為二價鐵外，還具有類似于酚氧化酶的活性，推測這種小分子物質在木質素降解過程中起著重要作用[4]。但是這種胞外具有類酚氧化酶的活性小分子物質在白腐菌中是否具有普遍性，值得深入研究。

一、材料與方法

（一）菌種

本研究采用菌種部份為實驗室自行篩選所得，部份為實驗室原有菌株。基本情況如下表所示。

（二）培養基及培養條件

適量麩皮及木粉，煮沸30分鐘，過濾后倒入300mL三角瓶中，接種后放于30℃搖床上培養。

（三）培養液提取及其成分分離

各菌培養一定時間后，將培養液離心取上清酶液放于0℃冷藏備用。以20mM pH 4.8的HAc-NaAc緩沖液對各菌酶液進行Sephadex G25分子篩層析，對層析液進行分步收集。對每管收集液進行漆酶及PO activity 測定。

（四）漆酶的測定

以2，6-DMP（2，6-二甲基酚）為底物，2mL pH值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，20mmol/L的2，6-DMP 50uL，酶液適量。30℃下檢測470nm處的吸收變化。消光系數ε=49600 mol-1Lcm-1 。以每分鐘轉化1umol底物定義為一個酶活單位。

（五）胞外小分子物質PO activity檢測方法

取樣品1mL及10mM 2，6-DMP1mL，測反應混合液在470nm處的吸光值變化。

二、結果與討論

實驗結果如表2所示，我們發現，在杏鮑菇、LG9、LG6、Lentinus lepideus、紅柄牛肝菌、BYBF、YDHSD2、Gloeophyllum saepiarium、真姬等這些真菌的Sephadex G25層析液中，都有具有PO活性的小分子物質存在。如圖1～所示，各圖中，系列1中的第一個峰與系列2中的第一個PO活性峰相對應，即為漆酶峰，系列2中其它幾個PO活性峰則是小分子物質的作用結果。

三、結論

以上結果表明，凡產漆酶的菌，均產具有酚氧化酶的活性小分子物質。而不產漆酶的菌，則都不產此種小分子物質。說明具有酚氧化酶活性的小分子物質在產漆酶的白腐中具有一定的普遍性。同時也可以推測，這種胞外的小分子物質在木質素生物降解過程中發揮著一定的作用，值得進一步深入研究。

系列1：酶液G-25層析圖譜 ?系列2：氧化DMP活性曲線

系列1：酶液G-25層析圖譜

系列2：氧化DMP活性曲線

系列1：酶液G-25層析圖譜

系列2：氧化DMP活性曲線（不含漆酶峰）

參考文獻

[1] Flournoy， D.S.， Kirk， T.K. and Highley， T.L. Wood decay by brown-rot fungi： changes in pore structure and cell wall volume [J]. Holzforschung， 1991， 45： 383-388.

[2] Flournoy， D.S.， Paul， J.A.， Kirk， T.K. et al.， Changes in the size and volume pores of sweet gum wood during simultaneous rot by Phanerochaete chrysosporium [J]. Holzforschung， 1993， 47： 297-301.

[3] 閆文超，黃峰，高培基等.對白腐菌胞外小分子物質的初步研究[J].中國造紙學報，2003，18（2）：47-50.

基金項目：本項目為國家自然科學基金資助項目（30170027），同時獲得教育部全國優秀博士學位論文作者專項資金資助（200023）和華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室資助。

作者簡介：閆文超（1979.06- ），男，漢族，貴州貴陽人，碩士研究生，副教授，研究方向：微生物。