黃芪甲苷預防性給藥對PM2.5誘導大鼠急性肺損傷病理結構的影響?

王振興，王智超，吳雨瀟，張 秀，肖 瑋，李水芹，王 飛△

(1. 成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610075； 2. 曲靖市中醫醫院，云南 曲靖 655000； 3. 成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610075)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是多種炎癥細胞介導的肺臟局部炎癥反應和炎癥反應失控所致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷[1]。近年來，隨著全球工業化和城市化建設的迅速發展，環境空氣污染成為新的全球疾病主導因素之一[2-3]。大氣污染特別是由于細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)所導致的霧霾天氣在全國各地區頻繁發生，已嚴重影響到公民的健康和生活質量[3-5]。

黃芪是豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，黃芪甲苷是其主要質量控制成分[6]，具有較好的免疫調節、器官保護、抗炎和調節細胞凋亡等作用[7]。課題組前期將PM2.5視作中醫病因學中環境毒邪范疇[8]，并探討了益氣解毒法防治PM2.5所致疾病的有效治法[9]。本次研究采用PM2.5標準品氣管滴注染毒誘導ALI模型，造模前給予不同劑量黃芪甲苷進行預防，并運用HE染色、McGuigan病理評分、透射電子顯微鏡觀察黃芪甲苷對PM2.5所致ALI模型的早期形態學變化影響，探討黃芪甲苷對PM2.5誘導ALI的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠40只，體質量150～180 g，購自成都達碩實驗動物有限公司(合格證號SCXK(川)2015-030)。實驗經成都中醫藥大學倫理委員會批準(編號：2017-03)，在成都中醫藥大學中醫臟腑病證實驗室分籠飼養。全程SPF級環境喂養，自由飲食飲水，飼養溫度(25±1)℃，濕度(55±5)%，12 h晝夜交替，動物福利按照國際相關實驗動物法規實施。

1.2 主要試劑與儀器

細顆粒物標準品SRM 2786(美國NIST)，黃芪甲苷(中國曼斯特，HPLC≥98.81%)，4%多聚甲醛(中國Bioshap)，DMSO(美國Sigma)，光學顯微鏡(日本NIKON)，透射電鏡(日本Hitachi)。

2 方法

2.1 細顆粒物及黃芪甲苷的配制

細顆粒物標準品SRM 2786購于美國國家標準與技術研究所，具體成分組成及成分分析詳見官網信息庫。使用前將SRM 2786溶解于生理鹽水，配置成SRM 2786混懸液，經超聲15 min振蕩混勻后使用。黃芪甲苷溶解于1‰DMSO的生理鹽水中，制成混懸液現配現用。

2.2 分組給藥及造模

大鼠適應性飼養3 d后，按照隨機數表法分為假手術組、模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量組(12.5，25，50 mg·kg-1)各8只。ip給藥，每日2次，連續給藥3 d[10-11],假手術組給予等體積溶劑。造模方法參考文獻及預實驗結果[12-13]，造模前12 h禁食，末次給藥30 min后，SRM2786混懸液氣管滴注(劑量為7.5 mg·kg-1b/周；每只大鼠滴注體積按1.5 ml·kg-1b/周計算；每日1次，隔日滴注1次，共計2次)誘發大鼠ALI模型。假手術組氣道滴注等體積生理鹽水，末次滴注0.5 h后[14]，右股動脈放血處死大鼠。

2.3 大鼠一般狀況和肺組織形態學觀察

實驗期間，全程詳細觀察記錄各組大鼠的飲食狀況、呼吸狀況、精神神態、被毛光澤和活動度等指標，記錄大鼠死亡情況。處死大鼠后，肉眼觀察肺瘀血和肺腫脹程度。

2.4 HE染色及McGuigan病理評分

取每只大鼠右側肺臟尖葉，經4%多聚甲醛固定48 h，酒精脫水，二甲苯透明，制成石蠟切片，切片厚度4 μm備用，經HE染色后觀察病理改變。ALI程度判定采用McGuigan病理評分法[15]，根據肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚或透明膜形成，分別進行0～4分半定量分析。0分：無病變或非常輕微；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變。McGuigan病理評分由兩位病理科醫師盲法判定評分結果。

2.5 透射電鏡觀察超微結構

取0.1×0.1×0.1 cm3右側中葉肺組織，即刻放入滴有三氯乙醛固定液的載玻片上，用載玻片輕壓肺組織直到小氣泡消失為止。將組織固定24 h后，用pH 7.0的PBS清洗樣本3次，每次15 min。然后用1%鋨酸溶液固定樣品2 h，去除固定液，第二次用pH 7.0的PBS漂洗樣品3次，每次15 min。隨后用不同濃度的乙醇對樣本進行脫水處置，每種濃度浸潤15 min后再用10%的乙醇浸潤 20 min，最后用100%丙酮浸透。丙酮和包埋劑混合，按1∶1比例將樣品在混合液中浸潤1 h，70 ℃下過夜。將處理好的肺組織切成厚度為50 nm的切片，并用枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色，用透射電鏡觀察肺組織全貌、局部和細胞器，重點觀測各實驗組肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞的超微結構。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠一般情況和肺組織形態學觀察

所有大鼠實驗期間無死亡。麻醉蘇醒后，假手術組大鼠呼吸平穩，精神活動恢復快，爪甲嘴唇無發紺和分泌物，對外界刺激反應正常，有進水現象。與假手術組比較，模型組大鼠活動量明顯降低，出現皮毛直立現象、精神萎靡、反應遲鈍、胸腹部喘息明顯等，偶有喘鳴音，唇舌黏膜發紺，鼻部有少量黑色粉末狀分泌物，無進水進食。與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組大鼠的活動量、皮毛色澤、唇舌黏膜等一般狀況均有改善，無胸腹部喘息，鼻部可見少量黑色粉末狀分泌物，偶有皮毛直立現象，其中黃芪甲苷中、高劑量組精神較好，偶有飲水。

肉眼觀察肺組織，假手術組兩肺外觀呈現淡粉紅色，顏色均勻，包膜完整，質地軟、彈性好，無瘀血點和腫脹。模型組兩肺腫脹，顏色暗紅，雙肺彌漫分布深紅色出血點，在肺表面出現明顯瘀血和水腫，質地相對粗糙。黃芪甲苷低、中劑量組與模型組比較，雙肺顏色較假手術組較深，體積略膨大，偶見散在出血點，但瘀血、水腫程度有所降低；黃芪甲苷高劑量組雙肺呈粉紅色，基本無出血點和瘀血，雙肺的損傷程度在給藥組中最輕。

3.2 各組大鼠肺組織HE染色結果

假手術組肺泡大小正常未見充血，肺組織基本未見出血，肺泡腔和血管壁可見少量中性粒細胞，未見肺泡壁增厚。模型組可見肺泡充血增多，肺組織明顯出血，肺泡腔和血管壁明顯可以觀察到中性粒細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚。黃芪甲苷各劑量組肺泡和肺組織基本未見出血，肺泡腔和血管壁中中性粒細胞浸潤。其中，低劑量組肺泡腔和血管壁中中性粒細胞程度比中、高劑量組增多，低劑量組肺泡壁一定程度比高劑量組增厚，與中劑量組無明顯差異。

3.3 各組大鼠肺組織McGuigan病理評分結果

與假手術組比較，模型組病理總積分顯著升高(P<0.01)，其中肺泡充血、出血、肺泡壁增厚或透明膜形成3項積分比較差異有統計學意義。與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組病理總積分均顯著降低(P<0.01)，其中中、高劑量組在中性粒細胞炎性浸潤或聚集上明顯優于低劑量組(與低劑量組比較，P<0.01)。此外，各給藥組肺泡結構較完整，基本無出血現象，其中高劑量組效果最優(與模型組比較，P<0.01)，中劑量組與低劑量組病變程度相似。

注：A.假手術組；B.模型組；C.黃芪甲苷12.5 mg·kg-1組；D. 黃芪甲苷25 mg·kg-1組；E. 黃芪甲苷50 mg·kg-1組(圖2同)圖1 各組大鼠肺組織病理HE染色結果比較(×100)

3.4 各組大鼠肺組織超微結構觀察結果

假手術組顯示，細胞結構較完整，肺泡上皮細胞排列整齊，邊緣清晰，無腫脹，無炎性浸潤，無明顯基底膜增厚，細胞核呈圓形；偶見肺泡巨噬細胞，細胞邊緣清晰，細胞內線粒體呈現桿狀，雙層膜結構正常，線粒體內嵴排列完整，未見腫脹或變形。

表1 實驗藥物對大鼠肺組織McGuigan病理評分影響比較

注：與模型組比較：*P<0. 05，**P<0. 01；與假手術組比較：▲P<0. 05，▲▲P<0. 01；與黃芪甲苷低劑量組比較：◆◆P<0. 01

圖2 各組大鼠肺組織超微結構比較(×25000)

模型組可見，肺泡上皮細胞結構紊亂、壞死、脫落，細胞質內部分板狀小體溶解呈排空狀，細胞核邊緣不完整，呈現不規則外形，甚至呈現核固縮現象；肺泡巨噬細胞較假手術組增多，細胞器內可見黑色顆粒物，線粒體腫脹明顯，線粒體體積較假手術組增加，甚至形成巨型線粒體，部分內嵴斷裂、消失或顏色變淺，內皮外基膜不完整。

黃芪甲苷各給藥組超微結構較為類似，肺泡上皮細胞邊緣完整，體積略增大，細胞質均勻，板層小體空泡化少，肺泡腔內脫落的炎性細胞較少，滲出物較少，細胞核較完整；高劑量給藥組低較、中劑量給藥組在肺泡巨噬細胞數量上明顯減少，細胞器內可見黑色顆粒物，線粒體體積較假手術組相似，但低劑量給藥組線粒體內嵴偶見斷裂，內外基本偶見不完整。

4 討論

PM2.5所致肺損傷是環境因素致病的典型代表，是呼吸系統疾病的研究熱點。PM是指懸浮在環境空氣中固體及液體顆粒的總稱，按其空氣動力學直徑分為超細顆粒物(PM0.1，≤0.1 μm)、細顆粒物(PM2.5，≤2.5 μm)以及粗顆粒物(PM10，≤10 μm)三類。一般來說，PM2.5具有更小的粒徑，并可吸附多種有機物、重金屬、病原微生物、酸性氧化物，故可以隨呼吸運動進入到下呼吸道，深達肺泡，甚至進入血液循環，導致呼吸系統及其他系統病變發生。大量流行病學研究顯示，PM2.5濃度升高所介導的肺損傷與呼吸系統疾病住院率、病死率密切相關[16]。長期暴露在PM2.5的環境中，可以顯著增加慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺癌、肺纖維化等呼吸系統疾病的發病風險[17]。因此，深入研究PM2.5所致肺系疾病的發病機制及如何運用中醫藥進行防治，在當下具有重要價值。

ALI是以肺微血管通透性增高引起的以肺泡-毛細血管受損為主要特征的急性炎癥性疾病，其主要病理學表現是急性肺水腫[1]。效應細胞反應失調是目前研究較為深入的病理機制[18]。研究顯示[19]，作為肺組織的主要防御者，肺泡上皮細胞和肺巨噬細胞損傷、功能紊亂在PM2.5刺激所誘導的ALI過程中扮演著重要角色。一方面[20]，肺泡上皮細胞在PM2.5的誘導下導致肺泡表面活性物質減少、耗能增加，導致細胞凋亡，是肺水腫形成的重要原因。在此過程，中性粒細胞在肺內被激活，釋放大量炎性介質、活性氧和蛋白酶加重肺水腫的形成。另一方面[21]，作為人體肺部的“清道夫”，肺泡巨噬細胞作為接觸和沉積PM2.5的重要靶器官，具有識別和吞噬PM2.5的重要作用。PM2.5可嚴重影響肺泡巨噬細胞的吞噬功能，造成肺功能障礙；不僅如此，肺泡巨噬細胞與PM2.5中所吸附的重金屬接觸后會導致促炎因子分泌的增加，引起肺泡巨噬細胞和肺上皮細胞的炎癥作用[22-23]。

與模型組比較，黃芪甲苷各給藥組能有效減輕ALI的肺泡充血、出血，減少中性粒細胞的浸潤和聚集，降低肺泡壁增厚或透明膜的形成。在肺損傷McGuigan病理評分上，與模型組比較，黃芪甲苷高劑量較低、中劑量組在肺損傷病理積分上具有統計學意義。此外，黃芪甲苷各給藥組還能保護肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞的超微結構，保護前者的包膜完整性，降低后者在肺內的聚集數量。通過以上結論可以推測，黃芪甲苷“益氣解毒”保護PM2.5誘導ALI可能的主要機制在于改善肺微血管通透性的基礎上，減少肺泡充血、出血，降低炎性細胞浸潤、黏附、遷移和激活；減輕失控的炎性因子對肺泡上皮細胞屏障的破壞，降低肺微血管的通透性；調節肺泡表面活性物質，減輕肺泡巨噬細胞的吞噬障礙，從而減輕巨噬細胞的免疫損傷。總之，本次實驗在中醫學治未病思想的指導下，宏觀與微觀相結合，證實了黃芪甲苷能有效改善PM2.5誘導大鼠的生存狀態，減輕肺水腫和肺組織McGuigan病理評分，從而實現預防PM2.5所致ALI的目的，這為臨床防治PM2.5提供了新的思路。