乳腺癌干細胞化學抗性及納米載體的應用

徐秀麗,馬金柱

0 引言

乳腺癌是全世界女性中最常見的非表皮類型癌癥，是女性癌癥相關死亡的主要原因[1]。目前，乳腺癌的患者通常接受多模式治療，包括手術、放射治療和藥物治療等標準方式[2]，前兩種方式主要用于根除原發性乳腺腫瘤和局部區域癌組織，藥物治療在乳腺癌術前及術后治療中發揮重要作用，它可以減輕腫瘤負擔，控制或治療癌癥轉移[3]。乳腺癌藥物治療可以實現全身治療，通常包括激素治療和化療。激素類藥物可抑制癌細胞增殖，化療主要應用細胞毒性化合物殺死癌細胞，但其有效性受到如下限制:一方面，其在腫瘤組織中的藥物濃度較低，而在健康組織中藥物含量高，導致療效下降，毒副作用增加;另一方面，即使藥物到達腫瘤，藥物或藥物組合本身也具有不良反應[4]。

在1994年Lapidot具有里程碑意義的白血病研究之后，Al-Hajj等[5]在乳腺癌中分離并鑒定出乳腺癌干細胞(BCSCs)，是實體腫瘤中分離出的第1批癌癥干細胞(Cancer stem cells,CSCs)。癌癥干細胞是腫瘤內細胞的一個小亞群，具有自我更新及分化能力,具有高致瘤能力，能夠在放、化療后重新填充腫瘤[6]。常見的乳腺癌化療藥物針對非CSCs，而CSCs仍可以存活，后者是乳腺癌耐藥及局部復發和/或遠處轉移的重要原因[7]。另外，乳腺癌的耐藥性可能與CSCs自身的某些特性相關，主要包括ABC轉運體的過表達、缺氧及所處的微環境。近年來，研究者提出了越來越多的具有抑制BCSCs作用的治療劑，例如沙利霉素、氯喹、姜黃素。然而，這些藥物大多數溶解性差，有脫靶效應、不穩定性、短循環半衰期、不符合期望的生物分布和低治療指數的特點，限制了其在體內有效應用。Gao等[8]研究結果表明，納米載體極大的表面積與體積比提供了高載藥量、溶解度增強效應、特異性位點遞送機制，可避免藥物在正常細胞和組織中沉積，并具有控制釋放機制，可為目標部位提供有效的藥物劑量，為乳腺癌的有效治療手段。本文回顧了BCSCs的起源、常見標志物及其所處微環境耐藥機制，并總結了3種最常見納米載體在靶向BCSCs中的最新進展。

1 BCSCs的來源

干細胞由3個主要特性來定義：分化、自我更新和穩態控制[9]，其對于身體的正常運作至關重要，是胚胎發育過程中及人的整個生命過程中組織或器官細胞的來源。腫瘤由異質細胞群組成，在乳腺癌中未分化細胞的少數亞群為BCSCs。關于BCSC的起源多年來一直存在爭議，目前關于BCSCs的來源主要有4種觀點[10]：①BCSCs是乳腺干細胞在靜止狀態期間發生的幾種有效突變引發致癌轉化而形成的。然而，Eun等[11]認為，雖然CSCs與正常干細胞共享幾個特征，這并不意味著CSCs起源于惡變的干細胞。②BCSCs是在瞬時擴增祖細胞水平上多個突變累積轉化引發的。③BCSCs來源于分化的細胞,分化的乳腺細胞被去分化后重新獲得干細胞特性和自我更新特性。④“錯位體細胞干細胞”理論認為，CSCs可能源于體細胞干細胞的錯位。目前，大多數研究者認為BCSCs來自乳腺干細胞和祖細胞[12]。最近有證據表明，腫瘤微環境的變化有助于MYC驅動的表觀遺傳重編程導致乳腺上皮細胞去分化為BCSCs樣表型[13]。無論提出的理論如何，迄今為止，還沒有具體證據證實BCSCs的起源。

2 乳腺癌干細胞標志物

近年來，人們對乳腺癌細胞系中的 BCSCs分子進行了廣泛的研究，BCSCs的分子研究將有助于更好地了解乳腺癌的生物學抗性，為發現新的治療靶點及當前治療方法的改進和預防疾病復發提供新的方向。目前，最常用的BCSCs標志物有CD44+、CD24-和ALDH1+，這些標志物在三陰性乳腺癌細胞具有更高的百分比[14]，在預測腫瘤反應、轉移和存活方面是非常重要的。特異性的生物標志物來表征BCSCs亞群顯示出顯著的腫瘤異質性，可揭示兩種不同的性質：標記CD44+/CD24-表型的BCSCs可將上皮細胞轉化為間質細胞 (Epithelial-mesenchymal transition,EMT);另一種是ALDH+表型標志的可將增生性上皮樣狀態的間質細胞轉化為上皮細胞(Mesenchymal-to-epithelial transition,MET)的BCSCs。BCSCs表現出CD4+的強烈表達[15],是Ⅰ類跨膜糖蛋白，由細胞外結構域、跨膜結構域和細胞質尾部組成，其作為透明質酸的主要受體將細胞微環境信號與生長因子和細胞因子信號集合在一起，并結合其他細胞外基質成分，例如膠原蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白可促進乳腺癌細胞的生長、侵襲和轉移性傳播[16]?？茖W家證明CD44+是可靠的癌癥干細胞標志物，既可單獨使用，也可與其他表面標志物聯合使用以識別BCSCs。CD24參與趨化因子受體CXCR4的負調節，是增強乳腺癌細胞黏附、增殖和轉移的唾液蛋白。通常CD24在BCSC中表達非常低或不存在，與乳腺癌細胞系中的化學抗性有關，CD24+細胞由輻射處理的CD24-/low細胞通過基因組不穩定性的傳遞產生[17]。最近另一個公認的標志物是ALDH+，其是一類參與細胞內醛氧化成羧酸和視黃酸的一種解毒酶[18]，主要在細胞質和線粒體中表達，通過酶測定和流式細胞術測量。在乳腺癌中，BCSCs中選擇性表達的ALDH1同種型包括ALDH1A1和A3,介導視黃醇向視黃酸的轉化，然后視黃酸作為細胞增殖調節劑起作用。據報道，高ALDH1活性也可通過將抗癌藥物代謝成無活性代謝物來預防細胞凋亡[19]。雖然CD44+/CD24-/low標志已被廣泛用于鑒定具有干細胞性質的乳腺癌細胞，但是關于其致瘤性目前仍存在爭議,需尋找新的和更可靠的干細胞標志物。

3 乳腺癌干細胞與耐藥性

用于治療侵襲性乳腺癌的常規療法最初可能是有效的，但隨著時間的推移，乳腺癌耐藥性是癌癥治療中持續存在的挑戰，是治療失敗的主要原因。臨床耐藥性的特征在于其不僅對一種藥物具有抗性，而且對于廣譜藥物通常也具有抗性，這種現象被稱為多藥耐藥性(Multidrug resistance,MDR)。BCSCs治療抵抗機制是多種多樣的，但其中最重要的抗性可分為兩大類:①由遺傳改變引起的內在抗性:即使所述藥物從未用于針對特定腫瘤，此類腫癌也存在對一系列藥物的抗性[20];②微環境所引起的外在抗性。研究發現，CSCs具有比非CSCs分化的腫瘤細胞高得多的內源性抗性機制，主要原因可能在于CSCs與正常干細胞之間的相似性[21]。由于干細胞維持生物體中的細胞庫，因此，保持和保護這些干細胞具有生物學必需性。針對乳腺癌常用治療藥物如順鉑、紫杉醇和多西紫杉醇的主要耐藥機制描述如下。

3.1 細胞膜轉運蛋白：ABC家族 目前，公認的乳腺癌細胞多藥耐藥性的一個原因是BCSCs表達高水平的特定ABC轉運體，由2個核苷酸結合結構域(Nucleotide binding domain,NBD)和2個跨膜結構域(Transmembrane domain,TMD)組成，底物識別和結合發生在TMD中，其形成孔狀結構并通向細胞外空間跨越膜的大部分深度。ABC轉運體屬于49個膜蛋白家族，通常使用ATP水解的能量以及底物易位將化合物和小分子從胞質溶膠轉運到細胞外介質，有助于多藥耐藥[22]。大多數ABC轉運蛋白作為主動轉運蛋白起作用，介導跨越血漿和細胞內膜的底物轉運，抵抗濃度梯度，ABC轉運體的丟失或抑制會影響與各種癌癥的分化、侵襲和惡性潛能密切相關的細胞表型[23]。

3.2 缺氧和活性氧 眾所周知,乳腺腫瘤在異常生長到一定程度時會引起組織的相對缺氧,造成局部形成缺氧微環境,使得機體誘導產生一系列缺氧效應,其中缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是介導細胞缺氧效應的關鍵轉錄因子。在高氧水平下，HIF-1α被泛素化并隨后降解，當氧含量降低時，泛素化被抑制并且激活HIF-1α轉移到細胞核中，HIF-1α與缺氧誘導因子-1B(Hypoxia-inducible factor-1B,HIF-1B)形成異源二聚體激活缺氧反應元件基因的轉錄[24]，這些基因促進血管生成以幫助輸送氧氣，激活增殖和存活途徑。缺氧以各種方式引起BCSCs抗性：首先，氧氣被稱為潛在的放射增敏因子，缺氧會引起更大的放射抗性。其次，缺氧可導致干性相關通路激活和細胞生長條件惡劣，誘導癌細胞靜止。激活的HIF-1α可誘導Wnt、Hedgehog通路的表達，減少活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產生來促進BCSCs的藥物抗性。與正常細胞相比，表達CD44+/ CD24-BCSCs中ROS清除基因、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶上調、較低的ROS水平可導致BCSCs群體對放、化療誘導的應激的高度抵抗[25]。另外，BCSCs標志物ALDH1通過直接去除氧自由基和間接產生抗氧化劑化合物誘導BCSCs的放射抗性[26]。ALDH1陽性腫瘤對紫杉醇和表柔比星耐藥，并且其耐藥性在化療后增加。

3.3 微環境和治療抵抗 CSCs的微環境被稱為“生態位”，BCSCs存在于由多種類型基質細胞組成的壁龕中。腫瘤微環境有助于BCSCs的生長和增殖，促進轉移和耐藥[27]。有報道，有幾種類型的細胞在腫瘤微環境中起作用，包括癌癥相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)、腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)、間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)和細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)，每種細胞都具有誘導腫瘤治療抗性的獨特方式[28]。

3.3.1 CAFs 刺激腫瘤細胞生長、增殖和轉移轉化的成纖維細胞被稱為CAFs[29]。CAFs是腫瘤微環境中最豐富的細胞類型，可以通過表達α平滑肌肌動蛋白、成纖維細胞活化蛋白、肌腱蛋白-C與正常成纖維細胞相區別。研究表明，CAFs通過分泌蛋白質、外泌體和ECM重塑因子誘導癌癥進展以及對癌癥治療的抵抗[30]。CAFs 分泌的卷曲相關蛋白2分泌減少以及Wnt10B、Wnt16B分泌增加導致Wnt信號通路的過激活,增加了p-糖蛋白和ATP結合盒G2的表達，這些蛋白質充當化學抗性的驅動力[31]。CAFs分泌的主要成分是轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β)，后者在降低乳腺癌干細胞的增殖率方面具有至關重要的作用，可促進癌細胞休眠，使BCSCs在化療期間保持靜止狀態[32]。另外，來自浸潤性乳腺腫瘤的細胞系將TGF-β1高水平分泌到培養基中，TGF-β是最重要的EMT誘導劑，可在這些細胞中誘導EMT[33]。此外，來自CAFs的生長因子FGF以自分泌和旁分泌的方式與受體結合，并激活增殖信號通路PI3K-AKT和促分裂原活化蛋白激酶，它們通過交叉激活，共享下游信號傳導途徑，增加了DNA依賴性蛋白激酶的表達，抑制促凋亡Bcl-X1和凋亡誘導因子的表達，從而減少對放、化療的反應[34]。

3.3.2 TAMs CD34+骨髓祖細胞作為單核細胞在血流中流動，滲入組織后分化成組織特異性巨噬細胞，在腫瘤微環境中被認為是TAMs。TAMs通過廣泛的生長因子、細胞因子和趨化因子共同與癌細胞相互作用,誘導治療抵抗。活化的巨噬細胞通常分為M1或M2。在腫瘤微環境中，TAMs主要分化為M2巨噬細胞，M2巨噬細胞具有致瘤功能，并且比M1巨噬細胞具有更低的細胞毒性。有報道，M2巨噬細胞通過分泌TGF-β和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)激活EMT信號傳導途徑和腫瘤微環境ECM重塑，誘導腫瘤細胞的EMT導致治療抵抗[35]。TAMs分泌的蛋白質如基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)可以引起血管生成，誘導治療抵抗[36]。

3.3.3 ECM ECM是主要由成纖維細胞分泌的分子的集合。為了形成腫瘤，癌細胞必須形成ECM的附著物。細胞外基質中的黏附分子與整合素在乳腺癌的耐藥機制中發揮重要作用:一方面，通過細胞黏附分子和整合素將癌細胞黏附到纖維連接蛋白或層黏連蛋白等細胞外基質成分中，誘導乳腺腫瘤細胞對阿霉素的耐藥性[37];另一方面，細胞表面黏附分子感知ECM的方式也影響核結構和染色質組織，這種染色質重組可以影響對結合或破壞DNA藥物的耐藥性[38]。在乳腺癌中，ECM也可形成物理屏障，將治療劑與癌細胞分開，從而保護CSCs免受化學治療劑的影響。此外，ECM含有幾種與CSCs中膜蛋白相互作用并激活干細胞和增殖信號通路以及耐藥性的蛋白，例如，ECM中豐富的透明質酸是BCSCs表面CD44+受體的配體，在交互時，其調節CSCs屬性的獲取和維護[39]。此外，肌腱蛋白C增強Wnt和Notch信號通路的效率，穩定乳腺癌。

3.3.4 MSCs MSCs作為骨髓來源細胞的亞群在結締組織中普遍存在，可以分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞和成纖維細胞，并在傷口修復和免疫反應中具有多種作用[40]。MSCs位于基質中時，分泌多種細胞因子和趨化因子，如CXCL12、CXCL7和IL-6/IL-8，激活NF-κB途徑，誘導BCSCs表型，這些分泌物也促進乳腺癌的治療抵抗。此外，MSCs和乳腺癌之間的物理相互作用激活非酪氨酸激酶受體Src及其下游PI3K/Akt通路，并增強對曲妥珠單抗的耐藥性。總體而言，MSCs在癌癥進展中發揮重要作用，并使癌細胞對治療方法具有抗性[41]。

4 納米醫學在乳腺癌干細胞藥物遞送中的應用

BCSCs具有獨特的生長恢復能力，包括自我更新能力，分化潛能，以及對包括放、化療在內的大多數抗癌藥物的耐藥性，有助于其發展和整體侵襲性[42]。目前關于BCSCs靶向且表征良好的生物標志物較少，因此，近年來，研究者提出許多靶向BCSCs制劑。由于這些藥物水溶性差、循環時間短、不穩定和脫靶效應，使其在臨床中應用失敗[43]。BCSCs靶向藥物遞送系統通過改善生物利用度，可特異性地將抗BCSCs藥物攜帶至BCSCs而不發生脫靶效應。目前，研究者較為關注的納米載體有聚合物納米顆粒(Polymer nanoparticles,PNPs)、脂質體、膠束[44]。其通常由3個部分組成：核心材料、治療藥物和表面改性劑。

4.1 聚合物納米顆粒 PNPs是廣泛用于藥物遞送的最公認的納米顆粒之一，是最簡單的納米醫學形式的軟材料[45]?？拱﹦┰赑NPs表面內或表面上被吸附、包封或綴合，其能夠在持續一段時間內向腫瘤部位提供所需劑量的抗癌劑。例如，制備硼替佐米(Bortezomib,BTZ)負載的聚(乙二醇)-b-(乳酸)納米顆粒[(poly ethylene glycol)-b-(poly lactic acid),PEG-b-PLA]可增強BTZ的水溶性和穩定性，有效地將BTZ遞送到BCSCs和非CSCs中，導致增殖抑制和細胞凋亡的啟動。與游離BTZ相比，通過納米顆粒的遞送增加了黏附細胞和球囊細胞中的BTZ攝取，延長BTZ的循環半衰期和增強腫瘤組織內的藥物積累。隨后，該研究小組在相同的PEG-b-PLA納米顆粒中包封多柔比星(Doxorubicin,DOX)和全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA),與游離藥物相比，包封的ATRA和DOX均具有較慢的體外釋放曲線，與單藥遞送相比，共體遞送系統在體外和體內均可抑制腫瘤生長[46]。此類雙重載藥納米顆粒系統的優點包括延長循環半衰期、改善藥代動力學和增加腫瘤攝取[47-48]。Chittasupho 等[49]將 CXCR4 的拮抗劑 LFC131裝載入聚丙交酯乙交酯(Polylactide glycolide,PLGA)納米顆粒中，并包埋強力霉素(DOX)，得到納米藥物LFC131-DOX-NPs，結果顯示，其可顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導凋亡，并抑制SDF-1Α對乳腺癌細胞的促轉移作用。

4.2 脂質體 脂質體是由兩親性磷脂雙層組成的膠體納米載體，其可以加載親水性和疏水性藥物。脂質體具有生物相容性、易于表面修飾和血液循環時間長的特點，是抗BCSCs治療的理想納米載體。Onivyde@是2015年FDA批準的伊立替康納米脂質體制劑，不是乳腺癌常用藥物，然而，在包含乳腺癌的晚期難治性實體瘤的Ⅰ期研究中，Onivyde?的疾病控制率為45.5%[50]。用吉西他濱(Gemcitabine，GEM)包封的透明質酸綴合的脂質體攻擊BCSCs，透明質酸結合的脂質體通過靶向BCSCs上表達的CD44+，顯著增強GEM的細胞毒性、抗遷移和抗集落形成能力,同時，可增強GEM在血液中的穩定性，并顯著降低GEM對正常健康細胞的全身毒性[51]。

4.3 膠束 聚合物膠束衍生于自組裝兩親性嵌段共聚物,這些膠體顆粒含有親水和疏水組分，為各種修飾提供平臺，以提高靶向效率。聚合物膠束由于其均勻性、小尺寸和延長的循環時間，成為用于抗癌治療的流行藥物載體[52]。在一項研究中，研究者們將PTX負載的和抗CD44+抗體功能化的PLGA-co-PEG聚合物膠束用于治療乳腺癌細胞系，結果顯示，將PTX包封到靶向的PLGA-co-PEG膠束中，增加了BCSCs對PTX的敏感性[53]。

5 結語

盡管在過去20年中乳腺癌治療取得了巨大進步，但乳腺癌仍然是女性最常見的惡性腫瘤。目前，大多數抗癌劑不能區分癌細胞和正常細胞，導致嚴重的全身毒性。此外，化療期間獲得性耐藥性進一步降低了治療效果。隨著癌癥干細胞理論的提出，BCSCs與實體腫瘤的分離以及對細胞、分子和信號通路的廣泛了解，強化了治療失敗和治療抵抗是由于癌癥干細胞的存在，這是一個具有高增殖性的亞群。BCSCs治療抵抗的因素包括ATP結合核轉運體過表達、ALDH1活性增加、ROS清除和腫瘤微環境。靶向BCSCs需要解決幾個關鍵問題，首先，BCSC標志物也被身體的正常細胞共享，難以控制與靶向BCSCs相關的不良反應；其次，目前BCSCs導致耐藥的機制尚未明確，難以開發靶向藥物。納米載體有明確的前景，通過適當的遞送載體，可以減少化療中的不良反應，克服BCSCs獲得的多藥抗性，并進一步提高療效。納米藥物載體具有調節持續藥物釋放、選擇性靶向腫瘤細胞、繞過藥物外排、改善藥物治療指數和逆轉腫瘤細胞中耐藥性的潛力。與游離藥物相比，納米材料包裹的藥物可以通過不同的機制進入靶細胞，以避免藥物轉運蛋白，并增加藥物的細胞內積累和逆轉耐藥性。納米載體與靶向技術相結合以克服或逆轉耐藥性是近年來重要且有前途的研究領域，需要進一步對納米醫學治療領域進行廣泛研究，以確保體內應用的安全性。