牛奶中6種黃曲霉毒素的檢測(cè)方法探討

張 佳 秦 娜 關(guān)婷婷 左英芳 柴 磊

(焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心,河南焦作 454003)

1 理化性質(zhì)

黃曲霉毒素（AFT）是有香豆素和雙呋喃環(huán)的化合物，是由寄生曲霉菌和黃曲霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因其在農(nóng)產(chǎn)品及食品中廣泛存在，并具有毒性和強(qiáng)致癌性而受到重視。目前已被鑒定的有20多種黃曲霉毒素，主要為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1、M2。前四種存在于農(nóng)產(chǎn)品中，如花生、玉米、麩皮、棉籽、水稻和小麥等。AFTM1、M2是黃曲霉毒素B1、B2被生物體（奶牛）吸收，經(jīng)肝微粒體單氧化酶系催化，經(jīng)羥化而衍生成的劇毒代謝產(chǎn)物，污染牛奶影響攝入機(jī)體生命安全。黃曲霉毒素破壞細(xì)胞膜，抑制 RNA 合成、干擾某些酶的感應(yīng)方式，主要攻擊免疫、造血、肝臟、腎臟、生殖和神經(jīng)系統(tǒng)，中毒癥狀為發(fā)育遲緩、腹瀉、肝損傷、免疫功能下降、癌癥等

2 檢測(cè)方法

因牛奶中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2同時(shí)存在，大量文獻(xiàn)介紹了黃曲霉毒素B1或M1的檢測(cè)方法，針對(duì)這6種黃曲霉毒素同時(shí)檢測(cè)的方法較少提及，因此探討同時(shí)檢測(cè)這6種黃曲霉毒素的測(cè)定方法意義重大。

2.1 薄層分析法

薄層色譜法前處理程序較復(fù)雜、耗時(shí)，靈敏度差，實(shí)驗(yàn)中接觸黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品安全風(fēng)險(xiǎn)高，因?qū)嶒?yàn)效率低，肉眼定性定量，準(zhǔn)確度不高，目前已較少使用。但作為黃曲霉毒素檢測(cè)的經(jīng)典方法，該法不需配備大型儀器，易操作入手。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法為快速檢測(cè)法，不需配昂貴儀器，操作步驟簡單，可作為風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)等大批量樣品的初篩。但此法只可測(cè)定黃曲霉毒素的總量，且有假陽性、假陰性的的可能。實(shí)際應(yīng)用中常聯(lián)合高效液相色譜法或超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)一步檢測(cè)。

2.3 高效液相色譜法

采用免疫親和柱或多功能凈化柱多次萃取和洗脫試樣，逐步分離出6種黃曲霉毒素，利用黃曲霉毒素在一定波長下發(fā)出藍(lán)紫色熒光，在熒光檢測(cè)器上定性定量。該方法前處理簡單、分離效果好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而廣為應(yīng)用。目前前處理凈化方法有免疫親和柱、多功能凈化柱，衍生方法有三氟乙酸（TFA）柱前衍生法、光化學(xué)柱后衍生法、碘和溴柱后衍生法、大體積流動(dòng)池直接檢測(cè)及光化學(xué)柱后衍生串聯(lián)大體積流動(dòng)池等。試樣處理后，凈化柱的黃曲霉毒素特異性抗體選擇性地與存在的黃曲霉毒素抗原鍵合，形成抗體-抗原復(fù)合體進(jìn)而洗脫分離出來。AFTB1、AFTG1生直接進(jìn)樣熒光效應(yīng)較弱，靈敏度低，衍生處理后可增強(qiáng)熒光度。

陳瑞春等冷凍離心分離出牛奶中的脂肪，代替加入氯化鈉、蛋白沉淀劑等，減少基質(zhì)干擾，免疫親和柱凈化，甲醇-乙腈混合溶液（4：5，v：v）洗脫，帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀經(jīng)柱后衍生系統(tǒng)衍生后測(cè)定，結(jié)果表明該方法法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高[1]。李紅艷等系統(tǒng)比較了柱后光化學(xué)衍生化、未衍生化及碘衍生化，試樣經(jīng)稀釋后免疫親和柱凈化，液相色譜儀-熒光法測(cè)定，柱后光化學(xué)衍生化價(jià)格較便宜，不需另配制衍生液，在線性范圍、靈敏度等方面綜合優(yōu)勢(shì)突出，易于推廣[2]。王軍淋等比較了TFA 柱前衍生、光化學(xué)柱后衍生、溴和碘柱后衍生及使用大體積流動(dòng)池直接檢測(cè)方法，結(jié)果表明各方法均能滿足要求，然而TFA 柱前衍生法成本較低、多功能凈化柱可滿足要求，但需接觸有毒有害試劑；光化學(xué)柱后衍生法樣品處理后可直接進(jìn)樣，但需配備光化學(xué)衍生器，增加管路的死體積，流動(dòng)相消耗量大；溴和碘柱后衍生法前處理相對(duì)簡單，也需配柱后衍生裝置，流動(dòng)相消耗量大；大體積流動(dòng)池兼具上述方法的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未推廣使用[3]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)免疫親和柱凈化效果優(yōu)于多功能凈化柱。

2.4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

該法通過對(duì)被測(cè)試樣離子的質(zhì)荷比（m/z）的測(cè)定而進(jìn)行分析的一種定性定量方法。質(zhì)譜分析儀器發(fā)展迅速，MS檢測(cè)器具有更高的選擇性，可用同位素內(nèi)標(biāo)法對(duì)分析物確證。GB5009.22—2016第一法介紹了采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中黃曲霉毒素B族和 G族的方法，GB5009.24—2016第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定乳中AFTM1和AFTM2的方法。目前尚無出臺(tái)同時(shí)測(cè)定牛奶中6種黃曲霉毒素液質(zhì)方法的標(biāo)準(zhǔn)。王勤等采用C8固相萃取小柱代替價(jià)格昂貴的多功能凈化柱和免疫親和柱，在正相萃取機(jī)制下，6 種黃曲霉毒素檢出限達(dá)1.0μg/kg，方法精密度良好，建立了食品中黃曲霉毒素的立固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，試驗(yàn)樣品為油脂類，是否適用牛奶有待考證[4]。