牛奶中6種黃曲霉毒素的檢測方法探討

張 佳 秦 娜 關婷婷 左英芳 柴 磊

(焦作市畜產品質量安全監測中心,河南焦作 454003)

1 理化性質

黃曲霉毒素（AFT）是有香豆素和雙呋喃環的化合物，是由寄生曲霉菌和黃曲霉菌產生的次級代謝產物。因其在農產品及食品中廣泛存在，并具有毒性和強致癌性而受到重視。目前已被鑒定的有20多種黃曲霉毒素，主要為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1、M2。前四種存在于農產品中，如花生、玉米、麩皮、棉籽、水稻和小麥等。AFTM1、M2是黃曲霉毒素B1、B2被生物體（奶牛）吸收，經肝微粒體單氧化酶系催化，經羥化而衍生成的劇毒代謝產物，污染牛奶影響攝入機體生命安全。黃曲霉毒素破壞細胞膜，抑制 RNA 合成、干擾某些酶的感應方式，主要攻擊免疫、造血、肝臟、腎臟、生殖和神經系統，中毒癥狀為發育遲緩、腹瀉、肝損傷、免疫功能下降、癌癥等

2 檢測方法

因牛奶中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2同時存在，大量文獻介紹了黃曲霉毒素B1或M1的檢測方法，針對這6種黃曲霉毒素同時檢測的方法較少提及，因此探討同時檢測這6種黃曲霉毒素的測定方法意義重大。

2.1 薄層分析法

薄層色譜法前處理程序較復雜、耗時，靈敏度差，實驗中接觸黃曲霉毒素標準品安全風險高，因實驗效率低，肉眼定性定量，準確度不高，目前已較少使用。但作為黃曲霉毒素檢測的經典方法，該法不需配備大型儀器，易操作入手。

2.2 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法為快速檢測法，不需配昂貴儀器，操作步驟簡單，可作為風險監測等大批量樣品的初篩。但此法只可測定黃曲霉毒素的總量，且有假陽性、假陰性的的可能。實際應用中常聯合高效液相色譜法或超高效液相色譜串聯質譜法進一步檢測。

2.3 高效液相色譜法

采用免疫親和柱或多功能凈化柱多次萃取和洗脫試樣，逐步分離出6種黃曲霉毒素，利用黃曲霉毒素在一定波長下發出藍紫色熒光，在熒光檢測器上定性定量。該方法前處理簡單、分離效果好、靈敏度高、定量準確等優點而廣為應用。目前前處理凈化方法有免疫親和柱、多功能凈化柱，衍生方法有三氟乙酸（TFA）柱前衍生法、光化學柱后衍生法、碘和溴柱后衍生法、大體積流動池直接檢測及光化學柱后衍生串聯大體積流動池等。試樣處理后，凈化柱的黃曲霉毒素特異性抗體選擇性地與存在的黃曲霉毒素抗原鍵合，形成抗體-抗原復合體進而洗脫分離出來。AFTB1、AFTG1生直接進樣熒光效應較弱，靈敏度低，衍生處理后可增強熒光度。

陳瑞春等冷凍離心分離出牛奶中的脂肪，代替加入氯化鈉、蛋白沉淀劑等，減少基質干擾，免疫親和柱凈化，甲醇-乙腈混合溶液（4：5，v：v）洗脫，帶熒光檢測器的高效液相色譜儀經柱后衍生系統衍生后測定，結果表明該方法法快速、準確、靈敏度高[1]。李紅艷等系統比較了柱后光化學衍生化、未衍生化及碘衍生化，試樣經稀釋后免疫親和柱凈化，液相色譜儀-熒光法測定，柱后光化學衍生化價格較便宜，不需另配制衍生液，在線性范圍、靈敏度等方面綜合優勢突出，易于推廣[2]。王軍淋等比較了TFA 柱前衍生、光化學柱后衍生、溴和碘柱后衍生及使用大體積流動池直接檢測方法，結果表明各方法均能滿足要求，然而TFA 柱前衍生法成本較低、多功能凈化柱可滿足要求，但需接觸有毒有害試劑；光化學柱后衍生法樣品處理后可直接進樣，但需配備光化學衍生器，增加管路的死體積，流動相消耗量大；溴和碘柱后衍生法前處理相對簡單，也需配柱后衍生裝置，流動相消耗量大；大體積流動池兼具上述方法的優點，目前尚未推廣使用[3]。同時發現免疫親和柱凈化效果優于多功能凈化柱。

2.4 超高效液相色譜串聯質譜法

該法通過對被測試樣離子的質荷比（m/z）的測定而進行分析的一種定性定量方法。質譜分析儀器發展迅速，MS檢測器具有更高的選擇性，可用同位素內標法對分析物確證。GB5009.22—2016第一法介紹了采用同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定食品中黃曲霉毒素B族和 G族的方法，GB5009.24—2016第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定乳中AFTM1和AFTM2的方法。目前尚無出臺同時測定牛奶中6種黃曲霉毒素液質方法的標準。王勤等采用C8固相萃取小柱代替價格昂貴的多功能凈化柱和免疫親和柱，在正相萃取機制下，6 種黃曲霉毒素檢出限達1.0μg/kg，方法精密度良好，建立了食品中黃曲霉毒素的立固相萃取-液相色譜-串聯質譜法，試驗樣品為油脂類，是否適用牛奶有待考證[4]。