補腎活血中藥對成骨細胞增殖、分化作用的研究進展*

李凱明，李玲慧，朱立國，王尚全，謝 瑞，張 清△

1.中國中醫科學院望京醫院脊柱二科(北京100102)；2.中國中醫科學院望京醫院骨傷綜合科(北京 100102)

中醫學認為“腎主封藏，受五臟六腑之精而藏之”，腎藏精，精生髓，髓居于骨中，以滋養骨骼。所以骨骼強勁，形體矯健，髓的生成，為“腎主骨”提供了物質基礎，故“腎主骨充髓”。補腎活血方源自《傷科大成》，具有補腎壯骨，活血止痛之功效。通過補腎壯骨以治本，活血化瘀以治標，為臨床應用中藥治療各類骨退行性疾病提供了科學依據。成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收之間的平衡是維持正常骨量的關鍵，是維持骨代謝正常過程的重要核心細胞。成骨細胞在不同階段釋放重要的活性標志物，像堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素等及各種細胞因子，如胰島素樣生長因子(IGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、骨鈣蛋白、轉化生長因子β等促進新骨形成。同時對破骨細胞骨吸收的調控，維持骨的代謝平衡方面起到重要作用[1]。近年來研究發現，補腎活血方藥在調控成骨細胞增殖、分化和功能作用方面具有一定的積極作用。本文將通過細胞、動物、臨床個體水平三個方面進行簡要綜述。

1 細胞水平研究

1.1 補腎活血中藥對成骨細胞增殖、分化作用 生物體最重要的生命活動是從細胞增殖、分化開始的，通過促進生物生長、發育、遺傳和繁殖，完成創傷修復的基礎生命活動。近年來,大量研究開始從分子生物學角度出發，探究中醫中藥對成骨細胞(OB)影響的作用機制,發現補腎活血中藥對骨形成和骨折愈合至關重要。林舉擇等[2]通過分離和培養大鼠顱蓋骨成骨細胞,采用實驗MTT法觀察成骨細胞存活和增殖能力，證實補骨脂有效成分在一定程度上對大鼠成骨細胞的增殖、分化方面具有明顯促進作用。王永東等[3]通過觀察發現,不同濃度黃芪水提液ALP活性顯著高于NS對照組(P<0.01)；礦化結節計數亦顯著高于NS對照組(P<0.01)。發現黃芪有效成分對成骨細胞體外增殖、分化及成骨能力受藥物濃度的影響較大，并且具有雙向調節作用。中藥地龍提取物中含有較高活性的促成骨細胞增殖、分化和基質礦化的有效成分。通過對實驗性牙槽骨吸收模型的治療發現，其可抑制骨吸收，使破骨細胞數目減少，骨密度增高，促進成骨活動使其修復重建[4]。舒曉春等[5]通過制備骨碎補總黃酮含藥血清，運用二次酶消化法，從新生SD大鼠顱骨中取得成骨細胞,發現其可以引起新生SD大鼠成骨細胞增殖,促進成骨細胞合成分泌ALP,且能增加成骨細胞骨鈣素的分泌,促進礦化結節的形成。牛膝為莧科牛膝屬植物干燥根，有散淤血、消腫痛、補肝腎、強筋骨之功效，為臨床常用藥物。研究發現，牛膝的醇提物及醇提物的乙酸乙酯萃取物脫皮甾酮對成骨樣細胞UMR106有顯著的促進增殖作用[6]。郭輝等[7]綜合運用MTT法，RT-PCR法以及對硝基苯磷酸鹽法，探究葛根素對成骨細胞的增殖、分化的作用機制。發現在不同濃度作用下，葛根素都可以提高成骨細胞增殖率，增強ALP活性，推動骨保護素mRNA的功能表達，從而抑制破骨細胞的分化和成熟。

1.2 補腎活血中藥對骨髓間充質干細胞細胞增殖、分化作用 骨髓間充質干細胞(Bone mesenehyal stem cells，BMSCs)在組織細胞修復過程中扮演著重要角色，可以在不同條件誘導下向成骨細胞、脂肪細胞、成骨軟細胞、心肌細胞、神經細胞等方面轉化，是一類具有多向分化潛能的干細胞[8]。現代研究表明補腎活血中藥調控BMSCs向成骨分化的機制，與《素問·陰陽應象大論》提出“腎主骨，生髓”具有相通性。所以臨床上可以通過補腎活血來有效促進骨髓間充質干細胞向成骨分化。劉琳等[9]采用密度梯度離心法分離多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者骨髓間充質干細胞(MM-BMSC)及正常人骨髓間充質干細胞(ND-BMSC)，觀察黃芪多糖對BMSCs增殖與細胞因子表達的影響，發現黃芪多糖促BMSCs增殖的作用明顯。為臨床治療MM患者減少其骨質破壞提供了一定的實驗依據。另有相關研究表明[10]，采用龜板含藥血清對BMSCs進行體外干預，同時使用流式細胞術檢測MSCs表面抗原CD44細胞標志,通過免疫化學染色、Western blotting、原位雜交、RT-PCR等方法，詳細記錄成骨分化標記分子堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)及VDR陽性表達及VDR mRNA的表達情況，從而探究龜板提取物對原代培養的MSCs向成骨分化的作用機制。發現龜板提取物誘導MSCs向成骨分化過程可明顯促進VDR mRNA的表達，其機制可能與VDR的上調有關。Li等[11]通過發現女貞子提取物可以改善BMSCs堿性磷酸酶(ALP)活性，增加礦化結節數目，對BMSCs成骨分化具有重要促進作用。鄧展生等[12]對骨碎補的有效成分柚皮甙對BMSCs增殖、分化的影響進行實驗研究，發現堿性磷酸酶(ALP)活性、von kossa鈣結節染色與空白對照組比較有明顯差異(P<0.05)。說明柚皮甙能有效促進BMSCs增殖、分化，增強堿性磷酸酶的生物活性，從而加速礦化結節的形成。張賢等[13]觀察杜仲誘導BMSCs成骨分化過程中Wnt通路相關信號分子表達，采用RT-qPCR法測定Wnt信號途徑中Fzd和LRP受體系列、β-catenin、核內Wnt調控靶基因系列及Wnt抑制因子(WIF1)等變化。發現Wnt信號途徑可能參與了杜仲促BMSCs的成骨分化過程。

2 動物水平研究

目前，研究使用最普遍的實驗動物模型是SD大鼠模型，廣泛用于藥理、毒理、藥效及GLP實驗。通過胎鼠顱骨成骨細胞體外培養實驗,觀察補腎活血復方含藥血清及原藥液在成骨細胞及骨髓間充質干細胞增殖、分化及礦化的作用，從而探究骨代謝的過程。

2.1 補腎活血復方對SD大鼠成骨細胞增殖、分化及功能作用 取SD大鼠的顱骨，徹底剝離骨膜等軟組織，對成骨細胞進行分離與培養。觀察補腎活血復方對成骨細胞增殖、分化(ALP活性測定)、礦化功能測定。胡冰等[14]用補腎健脾活血方含藥血清對SD大鼠成骨細胞進行治療干預，發現其能明顯增加成骨細胞增殖率和礦化結節形成數，明顯改善骨密度和骨強度的作用，還可改善骨的顯微結構，從而減少骨折的發生率。并且與含藥血清濃度呈正相關。鞠大宏等[15]通過原位雜交法檢測左歸丸含藥血清對成骨細胞OPG、RANKL mRNA的表達，發現左歸丸含藥血清可以促進成骨細胞分泌OPG，直接抑制RANKL的分泌，降低破骨細胞活性，從而維持骨骼的生物學性能和內環境穩態。林煜[16]等從成骨細胞整合素的功能狀態及信號轉導調控的研究對成骨細胞黏附的角度切入，探究健骨顆粒含藥血清有效成分對成骨細胞的意義，實時熒光定量PCR法檢測成骨細胞纖連蛋白、Ⅰ型膠原、玻連蛋白、黏著斑激酶mRNA的表達。結果發現健骨顆?？梢哉{節成骨細胞整合素和各種相關因子。使成骨細胞進入“分泌、黏附增加、功能增強、分裂增殖、分泌增加”的良性循環，促進成骨細胞骨形成。張榮華等[17]探究補腎活血液對新生SD大鼠成骨細胞增殖、分化、礦化的作用,分別用MTT法、對硝基苯基磷酸二鈉(PNPP)法、放免分析方法和茜素紅染色法測定細胞增殖功能、堿性磷酸酶(ALP)活性以及骨鈣素(BGP)含量和礦化結節計數。進一步證實了中藥復方補腎活血液對體外培養的新生SD大鼠成骨細胞的促進作用，可以提高骨量和改善骨質量。

2.2 補腎活血復方對SD大鼠成骨細胞增殖、分化作用機理 通過補腎活血復方對SD大鼠成骨細胞進行干預培養，可從動物水平探討補腎中藥防治骨質退化機制，不僅能為中醫“腎主骨髓，其充在骨”理論提供客觀理論依據，而且能更好地篩選出有效的臨床方藥。多數補腎活血方劑都是來源于臨床實踐，在此基礎上結合現代成骨細胞分離培養技術，通過補腎活血方劑的含藥血清或者提取物的干預，觀察成骨細胞增殖、分化等指標的變化。通常將堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(BGP)含量及礦化結節計數作為重要觀察指標，進行深入探究成骨細胞和分子機制[18]。堿性磷酸酶(ALP)是成骨細胞產生的一種重要酶蛋白，ALP活性表達是成骨細胞增殖、分化能力的特異性指標，其活性高低與成骨細胞分化能力呈明顯的正相關,是評價骨形成的最常見指標。骨鈣素可以在一定程度上反映成骨細胞活動分化狀態，也是體現成骨細胞分化作用的重要指標。閻德文等[19]通過觀察補腎填精中藥復方對大鼠BMSCs成骨增殖、分化作用的研究結果，發現其可以增加骨鈣素的分泌含量，推動ALP的表達活性情況，增強BMSCs向成骨細胞分化、成熟的能力。礦化結節計數的高表達作為細胞分化成熟的最后階段，是成骨功能的形態表現，是骨形成的重要標志。相關研究[20]通過研究不同濃度(5%、10%、20%)的強骨寶方糖尿病模型鼠含藥血清促進成骨細胞分化、礦化的影響，進一步探討其產生影響的最佳時相與量效。發現以20%濃度的含藥血清在以灌藥3d 或5d、末次灌胃后1 h取得，對體外培養的成骨細胞的分化及礦化功能促進作用最明顯。探究桂皮醛對成骨細胞增殖及成骨功能的影響與濃度相關性，通過堿性磷酸酶活性、鈣含量的測定及礦化結節的觀察等檢測五種濃度的桂皮醛對成骨細胞成骨功能的影響。發現較低濃度(16,8 μg/ml-1)的桂皮醛對成骨的增殖無明顯的抑制作用，對堿性磷酸酶ALP活力、鈣含量以及鈣化結節數量有明顯的促進作用[21]。相關實驗研究從動物水平分析了補腎活血復方對成骨細胞的直接作用，證實其對成骨細胞的增殖、分化及礦化的促進作用，為日后補腎活血復方更好地應用于臨床提供了理論依據和實驗支持。

3 臨床水平研究

臨床根據“腎主骨、“肝腎同源”的原理結合中醫辨證論治原則選用補腎活血復方治療骨和骨代謝疾病，主要通過成骨細胞與破骨細胞之間、骨形成和骨吸收方面的作用機制，多靶點、多環節發揮作用。后期實驗研究方面，存在有一定的難度，對于其相關作用機制，目前尚不能完全明確。

牛維等[22]認為補益肝腎及活血化瘀等中藥可提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,從而達到降低骨內壓,刺激細胞代償性增生作用,能改善關節軟骨的退行性變。根據中西醫結合治療原則，臨床上對于骨折手術患者，補腎活血復方通常作為首選方劑之一，注重藥物用量和配伍原則，達到補腎壯骨、活血通絡之效，從而促進機體修復，加速血液循環，實現骨折愈合的目的。現代藥理研究指出，益氣補腎活血方一方面可以有效分泌成骨細胞生長因子，豐富骨折斷段周圍毛細血管[23]，使局部血流通暢。另一方面有效改善機體骨代謝狀態，提高骨密度，優化關節功能，完善骨生物力學指標，從而進一步促進骨折愈合[24]。

4 展望與不足

近年來,補腎活血中藥對成骨細胞的研究方面已經取得了重大進展,不少驗方已得到臨床驗證,相關中藥制劑也已通過國家新藥審批，充分肯定了其對骨關節相關疾病的治療效果。大多數研究選擇補腎活血中藥，采用體內外同步研究的方法，明確了補腎活血方藥對成骨細胞的增殖、分化作用的相關機制，從分子生物學角度為臨床應用中藥預防和治療骨代謝疾病提供了理論依據[25]。但是補腎活血中藥對于成骨細胞領域的研究和應用仍存在不少問題亟待解決，筆者認為未來應加強以下幾個方面的研究：①成骨細胞取材、培養困難，加之倫理限制，是其在短時間內無法很好的解決。②與單味中藥相比，臨床多以補腎活血復方為主，其作用機制和有效成分也更為復雜，今后還需要進行深入探究，以期更好地應用于治療。③中藥血清制備方面，含藥血清的處理與保存，血清濃度的調控以及給藥的劑量和次數等需要統一規范和標準。④補腎活血中藥產生作用的生物學機制和有效成分的具體分析不夠全面。須進一步明確調控機制，分析中藥有效成分，研究不同細胞因子和信號通路在中藥調控成骨細胞分化中的作用。