電鏡技術在我國核桃屬植物研究中的應用

王承建，舒秀閣，梁 靜，賈 明，劉丙花，王小芳，于艷萍，趙登超*

(1.山東省航空護林站，山東濟南250014;2.山東省林業科學研究院，山東濟南250014；3.山東省日照市五蓮中學，山東日照262300)

電子顯微鏡，簡稱電鏡，把人眼睛的分辯能力從0.2mm 拓展至亞原子量級，顯著增強了人類觀察微觀世界的能力，被稱之為人類的“科學之眼”。 電子顯微鏡發明于20 世紀30年代，經過了近百年的發展，電子顯微鏡先后應用于醫學、生物學、化學、物理學和材料學等學科和領域，并與各學科相互交叉，相互滲透，協作發展。 隨著電鏡技術的不斷發展和完善，其與其他科學技術的相互協作也越來越廣泛，目前電鏡技術在植物學不同樹種上的應用也是越來越深入，尤其在植物細胞學、病理學和生理學等的應用越來越廣泛。

核桃( Juglans regia L.)為世界四大堅果之一，在亞洲、美洲和歐洲很多地區均有分布。 在我國作為重要的木本糧油樹種，從南到北在四川、山東、云南等21 個省（市、區）均有大面積的核桃生產性栽培，因為其適宜栽培范圍廣，在山地、丘陵或者平原地區均可進行種植，被人們稱之為‘鐵桿莊稼’。 核桃核仁營養豐富、口感清香，富含生育酚等物質，核桃殼產生顯著的經濟、生態和社會效益，作為我國重點發展的木本油料樹種之一，尤其在我國農村精準扶貧、農業產業種植結構調整和新農村建設等方面發揮了十分重要的作用。 隨著核桃產業的快速發展和相關基礎理論研究的深入，電鏡技術也越來越多地被科研工作者應用在核桃樹種的研究中，為此筆者查閱相關文獻，綜述了電鏡技術在我國核桃屬植物基礎理論研究中的應用和研究成果，同時根據當前核桃產業發展的需求和科學技術研究現狀，提出了電鏡技術在核桃屬植物的應用研究方向和重點，以期為相關人員在核桃方面的科學研究提供參考依據。

1 核桃屬植物孢粉學研究

研究表明，核桃花粉形態特征在遺傳上具有較強的保守性和穩定性，不同種屬的核桃花粉形態特征在研究確定核桃屬植物種類起源、進化或分類中具有十分重要的意義。 目前我國科研工作者利用掃描電鏡分別研究了核桃不同科屬、不同品種或者無性系花粉的形態特征。 毛霞等[1]研究發現胡桃科植物的花粉均為單粒花粉， 根據花粉大小的演化，認為楓楊的演化程度最高，美國山核桃的演化程度最低，而美國黑核桃、普通核桃、華東野核桃、和青錢柳為中等演化水平；根據周孔類花粉最進化，3 孔花粉次之，3 孔溝花粉較原始的原則[2]，認為美國山核桃花粉較核桃、青錢柳和楓楊原始；根據較原始植物花粉均具有光滑且無定型的外壁，花粉表面紋飾的演化趨勢為表面光滑→表面具小穴、 小溝狀雕紋→粗糙并具疣狀紋飾→表面顆粒狀→表面網狀分類原則[3]，核桃屬植物花粉表面紋飾均為密集分布的顆粒狀并分布在整個花粉表面，而普通核桃為較為進化的樹種。

劉壯壯等[4]和李川[5]等分別對美國薄殼山核桃和浙江山核桃無性系的花粉進行了掃描電鏡觀察，結果表明美國薄殼山核桃品種‘威斯頓’（Western）、‘卡多’（Caddo）、‘薩波’（Sauber）、‘斯圖爾特’（Stuart）、‘馬罕’（Mahan）和浙江薄殼山核桃無性系花粉以單粒形式存在， 美國薄殼山核桃花粉具有3個萌發孔，且均勻的分布在赤道面上，赤道面觀呈現出橢圓形，極面觀因品種不同呈現近圓形或三角形，‘薩波’的花粉體積最大，‘威斯頓’的花粉體積最小；‘威斯頓’、‘薩波’、‘斯圖爾特’、‘馬罕’ 的花粉表面紋飾較相似，均呈瘤狀紋飾，‘卡多’和‘威斯頓’為較進化的品種，‘薩波’則為較原始的品種；浙江山核桃無性系5 號和27 號極面觀呈近圓形，而無性系35 號極面觀呈近三角形； 三個無性系花粉粒形狀均為扁球形，花粉表面呈顆粒狀紋飾，均勻分布著顆粒狀的突起，表面紋飾差異不明顯。 寧萬軍等[6]利用電鏡研究了新疆早實核桃不同品種花粉粒形態特征，發現‘新新2 號’核桃花粉粒性狀為扁球形，其余為近球形，花粉大小為中等型；花粉外壁存在多個孔，‘新溫905’的孔5 個，較少，‘新新2號’的孔13 個，最多。 對比發現早實核桃萌發孔較山核桃萌發孔小，‘溫185’ 核桃品種花粉形態較為勻稱，為輻射對稱型。

2 核桃花芽分化形態學研究

研究表明果樹花芽分化對果實的產量品質均具有十分重要的影響，作為我國重要的經濟林樹種之一，核桃樹體花芽的質量、數量也決定了核桃產量、堅果的品質和質量，進而影響了核桃果農的經濟效益。 花芽分化的過程復雜，也是科研工作者關注的重點，目前我國科研工作者已對核桃的花芽分化進程，花芽分化的階段進行了劃分，鄧烈和高英等[7-8]利用電鏡分別觀察了‘阿4 號’、‘遼寧1 號’核桃品種花芽分化進程，人為的把其過程劃分為5 個時期，即成花誘導期、花柄分化期、苞片分化期、花被分化期和雌蕊分化期。 核桃花芽分化各個階段起始和持續時間不同, 主要與核桃栽培區域溫度、營養物質和品種不同而表現出顯著差異。 核桃雌、雄花發育形成時期不同，根據核桃雌花、雄花發育時間，可分為雌先型、雄先型。 雌先型核桃品種在花芽分化時間上要領先于雄先型品種，雌先型核桃品種在上個生長季完成花被原基的分化，而雄先型核桃品種在生長季當季雌蕊原基中僅完成苞片原基的分化，雌先型品種在進入休眠期之前比雄先型品種至少多分化一輪花器官原基，且與核桃不同品種的開花和展葉的時期無關[9-10]。通過電鏡觀察確定核桃雄花芽的分化過程和不同類型核桃品種花芽分化時間差異，對于調控核桃花芽質量，調節花芽分化與坐果的關系，保證其果實產量和品質具有十分重要的意義。

3 核桃良種嫁接愈合組織細胞學觀察

嫁接繁育良種是核桃優良品種和新品種有效推廣的重要技術途徑和手段，當前我國核桃良種繁育技術主要以芽接和枝接方法為主[11-12]，利用電鏡觀測嫁接愈合過程，對于了解和掌握核桃良種壯苗生長發育，促進生產高質量核桃良種壯苗，實現核桃的優質豐產具有十分重要意義。 兗攀等[13]研究了美國山核桃‘馬罕’枝接‘波尼’后嫁接體組織愈合的細胞學特征，結果表明，嫁接體嫁接愈合過程經歷可劃分為4 個時期， 愈合過程時間段為40d 左右，4 個時期分別為砧/穗隔離期、愈傷組織生長期、形成層環構成期和新生維管組織分化期，每個時期的時間間隔分別為5d ～15 d，嫁接后30d 左右為嫁接成活的關鍵期，愈傷組織的發生期與葉片展開在同一時期，主要產生于形成層處；嫁接未成活的砧穗結合體中愈傷組織較少，并發生褐化現象，不同條件導致愈傷組織生長受阻，可能是影響嫁接成活的重要內在因素。 為此作者認為實際的核桃嫁接（或者高接改優）生產操作過程中，如何為嫁接體愈傷組織的產生、生長和形成層環的構成提供有力的條件保障， 是嫁接技術改進的重要方向和目標，是實現嫁接成活和生產優質良種壯苗的重要途徑和保證。

4 核桃枝葉、果皮和種子超微結構觀察

利用電鏡研究核桃枝條和葉片組織結構，發現核桃枝葉顯微結構與核桃的抗逆性（抗旱、抗寒、耐鹽堿等）具有顯著的相關性，孫志超[14]通過試驗篩選出葉片海綿組織厚度、皮孔長度、柵欄組織與海綿組織厚度比和皮層厚度及導管長度5 個指標作為評價山核桃耐旱性能的技術指標。 抗寒性差的核桃品種‘晉龍1 號’細胞葉綠體和質膜損傷明顯，且在低溫條件下，超氧陰離子的濃度較高，葉片質球較多，葉綠體中基粒片層變薄，葉片的細胞質、線粒體及細胞核中Ca2+濃度始終處于較高水平， 細胞超微結構冷害明顯，部分幼葉葉緣呈水浸狀；抗寒性強核桃品種‘哈特雷’葉片中超氧陰離子濃度低，葉綠體中脂質球少，細胞內膜系統完整，葉肉細胞質中出現短時間的Ca2+高峰，隨后恢復到靜息態水平，細胞超微結構變化不大，葉片無明顯冷害癥狀；核桃細胞內膜系統的完整性與超氧陰離子積累之間可能存在一定的相互關系，低溫時葉綠體、線粒體可能起著臨時貯存Ca2+的作用， 以促進細胞質中Ca2+濃度回落到靜息態水平[15-16]。 核桃氣孔存在不均勻關閉現象， 鹽脅迫下氣孔導度存在明顯抑制現象，核桃氣孔完全關閉是， 保衛細胞中間有一條縫，核桃氣孔明顯的前后腔現象是氣孔的一個基本結構，鑒于核桃氣孔結構特征, 測量其氣孔開度時要進行正確的定位，同時為正確地區分氣孔的邊界與保衛細胞內側壁的外緣提供良好的植物樣本[17]。 核桃果實內維管束系統在果實表面有開放的端口，早實核桃與晚實核桃品種存在差異；內果皮（果殼）無維管束聯系，核桃果皮分為外、中、內3 層果皮組織結構，外果皮有數層細胞組成，前期表皮細胞密布腺毛，后期發育出角質層和氣孔構造；中果皮為果肉大部分，細胞大，中間散生多維管束；內果皮生長前期與中果皮不明顯界限，果皮細胞小而透明，生長后期內果皮木質化加速，進一步形成硬殼并轉化為石細胞層，其外的維管束組織高度發達成網格狀[18]。核桃果實成熟后掃描電鏡觀察果實核桃表面存在裂紋并有孔洞，實現與外界氣體進行交換，造成核桃種子不耐常溫貯存。 核桃枝葉抗逆性和果皮發育結構掃描電鏡觀察結果，為下一步制定適宜的生產栽培管理措施，提高核桃生長勢，提高果實產量和品質提供了有效的科學理論依據。

5 核桃木材及核桃殼加工性能

核桃渾身是寶，核桃木、核桃葉、核桃青皮和核桃殼等可加工為多種副產品，核桃木為優質的硬闊木樹種之一，被廣泛的用于軍工、家具制造或者雕刻材料等。 目前，我國科研學者利用掃描電鏡技術來研究不同樹種木材解剖、木材物理學和力學特征等方面的性質，為樹種的遺傳改良、木材質地性質提升提供了有力的科學依據[19-20]， 早在20 世紀80年代，我國科研工作者首次利用電鏡對中國的裸子植物木材進行了超微結構研究。 80年代末，王代運等[21]利用掃描電鏡對核桃楸木材導管分子及周圍細胞的關系和各分子大小在量的變化做詳細的測定。核桃殼作為重要的復合原料和生物質材料，因其資源再生性而被廣泛的應用。 高留意等[22]用鈦酸酯偶聯劑改性核桃殼粉，與廢白土、低密度聚乙烯制備復合材料，同時利用掃描電鏡觀察核桃殼粉及復合材料表面微觀形態，核桃殼粉無纖維細胞，木質素和半纖維含量較多，纖維含量較少，結果發現隨著廢白土用量的增加，復合材料的力學性能、熔體指數呈先升后降趨勢。 常州大學利用電鏡和紅外光譜分析油浴和微波預處理后的山核桃殼，發現山核桃殼緊密的結構遭到破壞， 變成更加易于酶解的松散、多孔結構[23]。 核桃殼也可作為一種高效吸附材料，李榮華等[27]以核桃殼粉為吸附劑，研究了其對Cr（Ⅵ）的吸附熱力學特征，利用掃描電鏡觀察發現，吸附Cr（Ⅵ）后的核桃殼殘渣表面變得光滑，并且棱角變的較為模糊，作者認為核桃殼對Cr（Ⅵ）的吸附不僅僅是一個單純的物理或者化學吸附過程，核桃殼表面的化學官能團與Cr（Ⅵ）在強酸性的環境條件下發生了氧化還原反應[24]認為核桃殼粉是具有吸附污水中鉻的能力和潛在利用價值的生物質吸附劑。 以上研究為核桃殼的綜合利用加工提供了有力的技術支持。

6 核桃病蟲鑒別觀察

電鏡技術可有效提高人類的分辨能力，尤其在昆蟲微小器官辨別等方面發揮十分重要的作用，我國科研學者利用電鏡觀察了核桃舉肢蛾和透翅蛾的器官形態特征[25-26]，發現核桃舉肢蛾雌蛾性腺和雄蛾觸角表面進行掃描電鏡觀察，發現核桃舉肢蛾性信息素分泌腺位于腹尖末端8-9 節之間, 為一個由節間膜特化而成的完整上皮環結構, 性信息素感受器有毛形感器和刺形感器，核桃舉肢蛾雄蛾觸角毛形感器較多可以很好的感知雌蛾的性信息素。 山核桃透翅蛾幼蟲頭部的形態特征、感器類型、分布特點并對部分感受器的功能進行了初步判斷，發現山核桃透翅蛾幼蟲的頭為下口式， 頭部有觸角、單眼、上唇、下唇、上顎、下顎、吐絲器等。 觸角上有3種感器：其中柄節無感器；梗節具有3 個刺形感器，2 個錐形感器； 鞭節上有1 個栓錐形感器和1 個錐形感器。 口器有7 種感器：其中上唇表面具有12 個刺形感器和1 個叉形感器；上顎莖節具有1 對刺形感器，顎葉和下顎須基部周圍有成簇的感覺錐。 顎葉端部有1 個感器，分別為1 個栓錐形感器，1 個錐形感器，1 個錐乳頭狀感器。為核桃舉肢蛾性信息素快速提取、分析、合成提供依據，同時為探討核桃透翅蛾的各器官功能機制提供理論依據。

7 研究展望

近百年來隨著電子顯微鏡技術的應用發展迅速，電鏡技術在核桃屬植物的科學研究中也發揮了十分重要的作用，通過‘科學之眼’做到眼見為實，清晰的觀察其形態學變化，本文綜述了目前電鏡技術在我國核桃屬植物孢粉學、花芽分化、嫁接愈傷、枝葉抗逆顯微結構、核桃殼加工性能和昆蟲微小器官辨別方面的應用，為核桃屬植物品種鑒別、進化分類、種苗繁育、資源抗逆性評價、副產品加工利用和蟲害鑒別等方面的科學研究提供了強有力科技支撐， 有效的加強了我國核桃學科基礎理論知識，從而促進了核桃產業發展。 認識到電鏡技術在核桃學科發揮重要作用的同時，與電鏡技術在其他學科或者樹種上的應用研究相比，電鏡技術在核桃屬植物方面研究還有待于進一步應用，尤其伴隨著新技術、新問題的出現，作者認為在核桃芽接體愈傷組織形成、核桃病原菌辨別與分類和高檔木材材質分析等方面還有待于進一步深入研究。 與美國、日本等發現國家相比，我國的電鏡技術和設備還相對弱后，可引進國外應用的激光焦距掃描顯微鏡、掃描激光聲音顯微鏡、 直接圖像顯微鏡等儀器設備，進一步開發其功能，提供儀器設備實用效率，合理高效利用現有資源和設備。 隨著今后多學科多技術的交叉與協同應用， 尤其是現代計算技術的融合發展，將使電鏡技術不斷地完善和提升，同時隨著電鏡樣品制備技術提升，將使電鏡技術在核桃屬植物的科學研究方面發揮更重要的作用，為核桃產業和學科的發展提供更有利的科技支持。