間充質干細胞調控細胞自噬機制的研究進展

米向斌 賴寬 魏姍姍

1南方醫科大學珠江醫院皮膚科（廣州510280）；2南方醫科大學南方醫院皮膚科（廣州510515）

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞[1]。MSC可產生大量生物活性物質，具有調節免疫、激活內源性干/祖細胞、促進組織損傷修復、促進血管新生、抗細胞凋亡以及歸巢等多方面的作用，被認為是一種有前景的治療手段[2]。MSC在許多疾病治療中都表現出很好的療效，特別是血液病、自身免疫性疾病、組織損傷性疾病和退行性疾病，但確切機制尚不完全明確。自噬是細胞內一種通過溶酶體降解長壽命蛋白和受損細胞器的代謝途徑，在細胞應激過程中起到了重要作用。MSC是近年來廣為研究的新治療手段，在自噬調控過程中的作用機制仍在探索。本文就MSC對宿主細胞自噬的調控機制作一綜述，為其基礎研究與臨床應用提供參考。

1 MSC與細胞自噬

自噬是真核生物特有的溶酶體介導的分解代謝過程，分為巨自噬、分子伴侶介導的自噬和微自噬3種[3]。目前巨自噬研究較清楚，mTOR通路、JNK/Bcl-2/Beclin 1通路、IP3和細胞內Ca2+都可以調控巨自噬的活性[4]。巨自噬是一種具有高度選擇性的降解過程，其中熱休克蛋白70（HSP70）在其途徑中發揮著重要作用。微自噬是將胞質直接吞入溶酶體，其分子機制與調控及對人類疾病的影響尚不完全清楚。Atg8家族蛋白是細胞自噬過程中重要的適配器蛋白，廣泛分布于自噬體的內外膜上，參與了細胞自噬過程中的許多關鍵步驟，比如自噬體的形成、成熟、招募降解底物等[5]。Atg8（在哺乳動物中的同系物是LC3蛋白）的羧基末端被蛋白酶Atg4B切割后形成胞質蛋白LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ進一步被磷脂酰乙醇胺脂化為LC3-Ⅱ，通常由LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值可以評價自噬的活化程度[6]。

在不同來源的MSC治療疾病的過程中，自噬都發揮著重要的作用。有學者[7-8]在用脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC）移植治療燒傷引起的神經性疼痛大鼠模型中發現，ADSC能明顯緩解大鼠的疼痛，并且降低大鼠灰質后角細胞中Beclin 1、LC3-Ⅱ的表達和自噬體數量。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）通過激活自噬而減輕INS-1細胞慢性高葡萄糖誘導的損傷和降低人肺微血管內皮細胞中缺血再灌注損傷（ischaemia/reperfusion-induced injury，IRI）的嚴重程度[9]。LI等[9]通過體內研究驗證了上述結論：BMSC可通過自噬促進T2D大鼠胰腺損傷的恢復和降低C57BL/6J小鼠肺IRI的嚴重程度。臍帶來源的間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，ucMSC）可作用于線粒體而調控T淋巴細胞自噬活性[10]。此外，人臍帶間充質干細胞（hucMSC）來源的外泌體（exosomes，Ex）通過自噬而減緩順鉑誘導的急性腎臟損害[11]。

目前越來越多的研究[12-13]表明，MSC治療關鍵點主要是旁分泌機制，而不是MSC本身。外泌體是起源細胞釋放的攜帶其特征表面抗原的小囊泡，是細胞間的旁分泌機制。外泌體可通過轉移RNA、蛋白質和生物活性脂質在細胞間作用中發揮關鍵作用，而且由于避免了干細胞移植可能導致的病理分化或腫瘤，外泌體在移植治療中可能比干細胞更有優勢[13]。

2 MSC移植對細胞自噬的調節作用

MSC可通過多條通路調節宿主細胞自噬，主要包括mTOR通路、STAT3通路和HO-1通路。MSC亦可通過自噬調控Aβ和α-突觸核蛋白而對神經退行性疾病起到治療作用。

2.1 mTOR通路mTOR是細胞內一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞生長、新陳代謝、衰老的中心控制器，在自噬調節方面起著重要的作用[14]。mTOR通路可通過以下途徑調控巨自噬的活性：（1）在營養豐富的條件下，Ragultor作用于RHEB而激活mTORC1，mTORC1激活可抑制巨自噬激活；（2）低ATP/AMP比例可激活AMPK復合物，進一步活化TSC1/TSC2而抑制RHEB，在這種情況下mTORC1被抑制而巨自噬啟動；（3）下降的PI3KI/Akt可間接失活mTOR而啟動巨自噬[15]。

JIANG等[16]在ADSC與大鼠軟骨細胞共培養時發現：ADSC可降低大鼠軟骨細胞mTOR、p-mTOR、p62的表達，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率和自噬體的數量而抑制其促炎因子的分解代謝。也就是說，ADSC可通過mTOR通路介導的自噬來調控軟骨細胞促炎因子水平。ZHOU等[17]用ADSC移植治療膝關節炎模型鼠時發現：ADSC可降低炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α，上調LC3-Ⅱ，下調p62、Akt、p-Akt、p-CAMKⅡ、CAMKⅡ、p-Smad1、Smad1的表達。ADSC可能通過p-Akt/Akt、p-CAMKⅡ/CAMKⅡ、p-Smad1/Smad1信號通路調控自噬活性而抑制軟骨損傷和細胞凋亡。

MSC移植在肺臟、腦IRI中也有一定的療效。LI等[9]在MSC移植治療肺IRI的過程中發現：MSC移植可增加宿主細胞PI3K classⅢ的表達，上調 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率，降低p62、PI3K classⅠ、p-Akt的表達；PI3K classⅢ作用于Beclin 1增加自噬活性，而PI3K/Akt可負性調控自噬活性。也就是說，MSC移植可通過PI3K/Akt或PI3K classⅢ/Beclin 1調控自噬活性。在另一個LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型中，MSC可通過下調肺內皮細胞中miR-142a-5p而調控Beclin 1介導的細胞自噬，從而逆轉小鼠肺部損傷[18]。HE 等[19]研究發現MSC可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路而啟動自噬，最終延緩腦IRI的進展。

2.2 STAT3通路STAT3與細胞能量代謝和細胞死亡密切相關，PKR與多種感染有關，STAT3抑制或缺乏可激活PKR而磷酸化eIF2α，此過程在感染性疾病中發揮著重要作用。一項關于原發性膽汁膽管炎的體外研究[20]發現，hucMSC可降低宿主細胞炎癥因子水平，增加自噬活性。人肝內膽管上皮細胞與hucMSC共培養后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率升高，p62、STAT3和p-STAT3表達下降；在沉默肝內膽管上皮細胞的STAT3后，無論是否與hucMSC共培養，兩組p-eIF2α、PKR均表達上升，提示hucMSC可通過STAT3/PKR/eIF2α通路而啟動自噬。

2.3 HO-1HO-1是一種應激誘導型酶，具有抗炎、抗細胞凋亡、抗氧化的潛力，HO-1可通過調節氧化應激預防肝IRI。WANG等[21]在BMSC移植治療肝IRI的研究中發現，BMSC可通過HO-1增強自噬活性而對肝臟IRI起到保護的作用。研究中用3-甲基腺嘌呤抑制自噬、鋅原卟啉IX抑制HO-1，3-甲基腺嘌呤和鋅原卟啉IX兩者均可阻斷BMSC對自噬的作用。BMSC可通過HO-1介導的自噬來保護肝臟免受IRI。

2.4 α-突觸核蛋白α-突觸核蛋白是一種在中樞神經系統突觸前及核周表達的可溶性蛋白質，是路易小體的主要成分，與帕金森病的發病機制和相關功能障礙密切相關。α-突觸核蛋白異常積累是由于tau磷酸化誘導的軸突運輸缺陷引起的，是造成黑質多巴胺能細胞損失的主要原因。OH等[22]研究發現MSC可通過調控自噬相關的tau磷酸化，緩解微管依賴性軸突運輸障礙來減少α-突觸核蛋白的積累，從而發揮神經保護作用。總而言之，MSC可能通過增強神經元細胞自噬的活性來減少其α-突觸核蛋白的累積，最終神經元細胞存活增加，帕金森病情好轉。

2.5 β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）Aβ是由36～43個氨基酸組成的多肽，由BACE1/β-分泌酶和γ-分泌酶對淀粉樣蛋白前體蛋白連續蛋白水解而成，Aβ積聚是阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）發病的基礎。XU等[23]用小膠質細胞與ucMSC共培養時發現，小膠質細胞中LC3Ⅱ、Beclin-1、Aβ降解酶IDE和Nep的表達升高，Aβ25-35減少，細胞凋亡減少，結果表明ucMSC可通過調控自噬來保護小膠質細胞免受Aβ25-35誘導的細胞損害。綜上可知，MSC移植可增強AD模型中自噬活性和Aβ的清除，最終神經元細胞存活增加，疾病本身得到緩解。

3 MSC來源的外泌體對自噬的調節作用

MSC來源的外泌體可通過mTOR通路、p53-Bnip3通路調控宿主細胞自噬，從而對疾病起到治療作用。但是由于目前的研究有限，外泌體與MSC移植的作用機制或療效的差異仍是一個謎團，有待進一步的研究。

3.1 mTOR通路WANG等[11]在大鼠腎上皮細胞與hucMSC-Ex共培養時發現，hucMSC-Ex可增加NRK-52E中腎上皮細胞的表達，并上調自噬相關基因atg5、atg7。此外，體內研究顯示：hucMSC-Ex移植對腎毒性大鼠模型有治療作用，可下調腎臟組織中mTOR、p-mTOR及其下游p70S6K和4EBP1蛋白的表達[11]和炎癥因子TNF-α，促進IL-1β、NF-κB-P65的分泌。由此可以推測hucMSC-Ex可通過mTORC1通路介導的自噬來緩解大鼠腎臟損害。EBRAHIM等[24]用MSC-Ex治療糖尿病腎病大鼠：相對于正常對照組，糖尿病腎病大鼠的mTOR通路被激活，而自噬被抑制；MSC-Ex移植治療后可降低mTOR、S6K1和p62的表達，升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率，同時降低炎癥因子TGF-β，說明MSC-Ex可通過mTOR通路調控自噬而治療糖尿病腎病。此外，LIU等[25]用MSC-Ex移植治療心肌IRI模型鼠中發現，MSC-Ex可通過AMPK/mTOR、Akt/mTOR通路調控心肌細胞自噬來治療心肌IRI。

3.2 p53-Bnip3p53基因是一種典型的腫瘤抑制基因，能調控細胞增殖和凋亡，Bnip3是Bcl2/腺病毒E1B-19 kDa蛋白相互作用蛋白3，這兩個都是已知的自噬激活劑。p53、Bnip3在小鼠心肌梗死模型中表達升高，MSC-Ex與分離的心肌細胞共培養后可降低心肌細胞p53、Bnip3的表達以及自噬泡、自噬溶酶體數量，說明MSC-Ex可通過p53-Bnip3而調控自噬活性[26]。XIAO等[26]研究發現MSC-Ex中富含miR-125b-5p，而miR-125b-5p的靶基因是p53。在缺氧和血清剝奪培養的新生小鼠心肌細胞中，自噬通量、細胞死亡和p53-Bnip3信號通路活性增加；當細胞與MSC或MSC-Ex共培養時，信號通路活性和自噬相關指標下降，但是當外泌體抑制劑（GW4869）作用于心肌細胞時，這些改變會消除，也就是說MSC是通過旁分泌機制（外泌體）介導的p53-Bnip3通路調控心肌細胞自噬。在隨后的MSC-Ex移植治療心肌梗死模型鼠中，得到了與體外實驗相似的結果，也就是說MSC-Ex可通過自身攜帶的miR-125b-5p作用于p53-Bnip3通路而調控心肌細胞自噬。

4 MSC研究與應用現狀

MSC移植已廣泛應用治療白血病等血液系統疾病，在系統性紅斑狼瘡等免疫疾病中也得到了不錯的療效[27]。MSC移植已用于治療心肌梗死、難治性糖尿病、肢體缺血性疾病患者的臨床試驗并得到了好的療效，在腫瘤、神經系統修復、肺部損傷等方面的研究暫時仍在動物實驗階段，未應用在臨床。

MSC是治療心臟疾病最有潛力的手段，移植后可歸巢到損傷的心肌部位，并根據微環境的不同分化表達肌球蛋白、肌動蛋白或肌鈣蛋白等；亦可分泌細胞因子，如心血管生長因子，發揮修復損傷心肌的作用。STRAUER等[28]用MSC移植治療慢性心肌梗死患者，結果顯示患者心肌梗死面積減少30%，左心室射血分數增加15%，而對照組未見明顯變化。MSC移植對難治性糖尿病或合并嚴重并發癥的患者也有好的療效[29]，其作用機制可能為：（1）MSC分泌多種細胞和生長因子；（2）MSC直接或促進胰腺導管上皮內的胰腺干細胞分化為B細胞。BHANSALI等[30]的一項隨機雙盲的臨床研究選取20例難治性2型糖尿病患者，隨機接受MSC和安慰劑，結果顯示MSC移植組胰島素用量顯著下降，且胰島素C肽水平顯著提高。此外，MSC移植可誘導缺血區血管的發生、增加毛細血管的密度和血流量。AMANN等[31]用BMSC移植治療嚴重肢體缺血患者，納入標準為最大保守治療失敗需要截肢者，移植后6個月時可使59%患者免于截肢，但此方法仍處于臨床試驗階段，需要更多的臨床試驗才能獲得推廣。

5 展望

MSC移植作為一種頗有前景的治療手段，迄今為止，已經在全世界范圍內開展了881項臨床實驗研究。然而令人遺憾的是，其具體的作用機制尚不完全明確。自噬是真核細胞中重要的物質降解過程，在MSC治療過程中也發揮著重要的作用。目前對于MSC移植過程中自噬的調控機制正在被逐漸認識和解析，但具體的分子機制仍不是十分清楚，進一步研究自噬及其相互作用，將有助于深入了解MSC的治療機制，也為其應用于臨床提供實驗室基礎。