不同時間睡眠干擾致小鼠體力疲勞模型的建立

黃 紅，姜 寧，呂靜薇，楊玉潔，陳碧清，王 瓊，劉新民*，呂光華，4*

(1. 成都中醫藥大學藥學院，成都 611137；2. 中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；3. 西南醫科大學藥學院藥理教研室，四川 瀘州 646000； 4.成都中醫藥大學民族醫藥學院，成都 611137)

疲勞是一種漸進性主觀感受，造成疲勞的原因可分為生理性(即運動性)和心理性。生理(運動)疲勞是肌肉暫時無法保持最佳的身體機能，并且會隨著劇烈的運動而越發嚴重的狀態[1-3]。根據1982年第五屆國際運動生化會議，運動性疲勞是指，機體生理過程不能持續其機能在一特定水平或各器官不能維持預定的運動強度。在我國，40歲以上的白領階層中，75%屬于亞健康人群，40%主訴慢性疲勞[4]。因此，篩選具有抗疲勞或改善疲勞的保健食品/藥物，是當今科學研究的一大熱點。目前，動物研究中常見的疲勞模型主要有跑臺[5]、游泳[6]、束縛[7]、睡眠剝奪(水平臺法)[8]等。本實驗室前期研究結果表明滾筒法睡眠干擾(sleep interruption，SI)可導致小鼠學習記憶障礙[9-10]和抑郁等腦力疲勞[11-12]。本實驗采用滾筒法對動物進行不同時間的睡眠干擾，研究造成小鼠體力疲勞的干擾強度，為體力疲勞慢性模型的建立和防護產品研發提供一種穩定可靠的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

ICR雄性小鼠48只，SPF級，體重21～23 g，5～6周齡，來源于北京維通利華實驗動物公司[SCXK (京) 2016-0006]。實驗在中國醫學科學院藥用植物研究所動物實驗設施內進行[SYXK (京) 2018-0020]，倫理委員會審批號：SLXD-201803170028，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。動物適應性喂養3 d后，按體重分為睡眠干擾5 d組、10 d組、15 d組和空白對照組，每組12只，自由飲食飲水。實驗室安靜，溫度24℃，12 h照明/12 h黑暗環境(8:00 a.m.開燈)。

1.2 主要試劑與儀器

血清尿素氮和肝糖原試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。大小鼠睡眠干擾儀、小鼠自主活動實時測試分析處理系統、小鼠轉輪式疲勞儀、小鼠負重游泳測試分析系統均由北京康森益友公司、儀康科技(北京)有限公司聯合研制；變溫紫外-可見分光光度儀(Agilent Cary100，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 睡眠干擾實驗

大小鼠睡眠干擾儀由滾筒和控制機箱兩部分組成。自行設定控制參數，使干擾儀以不同模式轉動對滾筒內飼養動物進行不同時長睡眠干擾。睡眠干擾組：先將睡眠干擾15 d組放入滾筒內，5 d后將睡眠干擾10 d組放入滾筒內，10 d后將睡眠干擾5 d組放入。滾筒直徑40 cm、長22 cm，每個滾筒放一組動物(12只)，滾動參數為：3 r/min，每轉1 min，間隔1 min；在干擾造模時間點取出測試組進行行為學檢測，測試完畢后繼續放入滾筒進行睡眠干擾，直至行為學檢測完全結束。對照組常規飼養。

1.3.2 轉輪實驗

于滾筒法睡眠干擾第16天，采用轉輪式疲勞儀進行測試，條件：轉速25 r/min、刺激電流0.2 mA[13]。轉輪底端有刺激電流，為避免電擊，小鼠必須保持跑動狀態。當小鼠力竭時，會跟不上轉輪速度，滑到轉輪底端，小鼠身體觸碰到整個電路造成短路，轉輪停止轉動，儀器自動記錄力竭時間。

1.3.3 負重游泳實驗

于滾筒法睡眠干擾第17天將小鼠置于獨立自動檢測的游泳箱中游泳，水溫(25 ± 0.5)℃[14]，鼠尾根部負荷10%體重的鉛皮[15]，水深≥ 25 cm。自動記錄小鼠自游泳開始至力竭時間段內的行為。力竭時間從小鼠頭部沉入水中，經7 s仍不能返回水面為止。游泳結束后，立即撈出小鼠，擦干小鼠身上的水分，放回原來的籠中。

1.3.4 生化指標的測定

于負重游泳實驗前半個小時對各組小鼠禁食，負重游泳實驗結束半小時后，取血，4℃靜置4 h，低溫離心后，分取血清。小鼠脫臼處死，取肝組織以冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，于-80℃貯藏。血清尿素氮和肝糖原的含量按試劑盒說明書測定。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同睡眠干擾時間對小鼠體重的影響

圖1顯示，經過5, 10, 15 d睡眠干擾后，與對照組比較，睡眠干擾組體重均明顯降低(P< 0.05)。

注：SI，睡眠干擾；下圖同。小鼠每5 d稱重一次。各干擾組與對照組比較，*P < 0.05。圖1 不同睡眠干擾時間對小鼠體重的影響Note. SI, sleep interruption; the same in the following figures. Mice were weighed every 5 days. SI groups compared with the control group, * P < 0.05.Figure 1 Effect of different sleep interruption time on the body weight of mice

2.2 不同睡眠干擾時間對小鼠轉輪力竭時間的影響

由圖2可見，各睡眠干擾組與對照組比較，轉輪力竭時間差異無顯著性(P> 0.05)，但呈現出干擾時間越長，小鼠力竭時間減少的趨勢。

注：A：對照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。圖2 不同睡眠干擾時間對小鼠轉輪力竭時間的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group.Figure 2 Effects of different sleep interruption times on the rotating wheel exhausted test time

2.3 不同睡眠干擾時間對小鼠負重游泳力竭時間的影響

游泳實驗結果如表1所示。表1中，睡眠干擾10 d、15 d組與空白對照組比較，負重游泳力竭時間明顯縮短(P< 0.05，P< 0.01)；睡眠干擾5 d組與對照組差異無顯著性(P> 0.05)。下沉次數和下沉總時間反映了小鼠在負重游泳過程中的耐力，耐力程度與下沉次數和下沉總時間成正比。睡眠干擾10 d、15 d組與正常對照組比較，下沉次數和下沉總時間顯著減少(P< 0.01)；睡眠干擾5 d組與對照組差異無顯著性(P> 0.05)。

表1 不同睡眠干擾時間對小鼠負重游泳的影響Table 1 Effect of different sleep interruption times on loaded swimming

注：SI，睡眠干擾。與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. SI, sleep interruption. SI groups compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.4 慢性疲勞模型對小鼠血清尿素氮的影響

如圖3所示，睡眠干擾10 d和15 d組的血清尿素氮含量較空白對照組顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)。而干擾5 d組僅有上升趨勢，差異無顯著性。

注：A：對照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖3 不同睡眠干擾時間對小鼠血清尿素氮的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group.SI groups compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 3 Effects of different sleep interruption times on serum urea nitrogen in the mice

2.5 慢性疲勞模型對小鼠肝糖原的影響

如圖4所示，睡眠干擾5 d和10 d組的肝糖原含量較空白對照組顯著降低(P< 0.01)，睡眠干擾15 d組的肝糖原含量較空白對照組顯著降低(P< 0.05)。

注：A：對照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 不同睡眠干擾時間對小鼠肝糖原的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group. SI groups compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 4 Effects of different sleep interruption times on hepatic glycogen in the mice

3 討論

負重游泳時間的長短可以直接反映動物運動疲勞的程度，本實驗采用自主研發的小鼠負重游泳實驗系統，能采集除力竭時間外的其他評價小鼠耐力的指標[14]。負重游泳力竭實驗中，睡眠干擾10 d、15 d組與空白對照組比較，首次下沉時間和首次連續下沉時間明顯縮短，但是差異無顯著性，主要是由于小鼠間存在個體差異；負重游泳力竭時間、下沉次數、下沉總時間等耐力性指標顯著縮短，這說明睡眠干擾10, 15 d均可造成小鼠運動耐力顯著下降。轉輪實驗中各睡眠干擾組與對照組比，呈現出干擾時間越長，小鼠力竭時間越短的趨勢，但是差異無顯著性。推測本模型造模原理與轉輪相似，因此在轉輪評價小鼠耐力上不敏感。

糖原的含量能說明疲勞發生的快慢或程度。肌糖原消耗的同時，為維持血糖水平，肝糖原儲備量減少[16]。尿素氮含量是蛋白質和氨基酸代謝的重要產物之一，運動負荷增加，機體能量代謝平衡被破壞時，蛋白質分解供能，血中尿素氮的含量增加。其與機體機能、疲勞程度呈正相關[17]。本研究結果顯示睡眠干擾各組與空白對照組比較，睡眠干擾各組肝糖原含量均出現顯著降低；睡眠干擾10 d、15 d組較空白對照組的血清尿素氮含量顯著升高。說明由于游泳力竭，小鼠機體代謝糖供應不足，蛋白質開始分解供能。睡眠干擾5 d組僅造成了肝糖原與對照組相比降低，負重游泳和血清尿素氮檢測結果均為陰性，說明睡眠干擾5 d不能造成小鼠的體力疲勞。

綜合上述行為學和生化指標檢測結果，ICR小鼠在滾筒式睡眠干擾所致慢性疲勞的行為學表現中，干擾10 d和15 d均可致小鼠表現出體力疲勞行為，進一步完善后，將為睡眠障礙所致慢性疲勞的發病機制、篩選改善睡眠運動障礙所致體力疲勞藥物和保健品的研發提供一種穩定可靠的動物模型。