5-氟尿嘧啶聯合機械劃傷致金黃地鼠口腔黏膜炎模型的建立

唐曉麗，楊 霖，楊 依，張宇軒，陳瀲月，方 芳*

(1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010)

口腔黏膜炎(oral mucositis，OM)是腫瘤患者接受放化療后常出現的并發癥，主要表現為口腔組織出現紅斑、變薄，隨著組織繼續變薄，最終會發生潰瘍[1-2]。OM引發的疼痛、吞咽困難及食欲減退等，嚴重影響患者生活質量[3]。目前，對OM的防治措施主要有冷凍療法、激光療法、抗菌消炎劑、細胞保護劑及細胞因子等，雖然防治方式多樣，但臨床上還未有被大家公認的療效確切的防治方法[4]。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是細胞周期特異性的細胞毒類抗癌藥物。臨床資料顯示[5]，應用5-FU化療導致OM的發生率為28%左右。本研究給金黃地鼠腹腔注射5-FU聯合機械劃傷頰囊，通過相關指標檢測建立OM動物模型，為進一步開發防治OM的藥物提供穩定的實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12只SPF級雄性金黃地鼠，8～9周齡，體質量130～150 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京) 2016-0011]。動物實驗經由實驗動物倫理委員會批準(批準號：BUCM-2-2018031101-1003)，在北京中醫藥大學屏障環境動物室進行[SYXK (京) 2016-0038]，每籠飼養3只金黃地鼠。實驗動物的使用按照3R原則給予人道主義的關懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

5-氟尿嘧啶(美國MedChem Express公司，批號：HY-90006/CS-0993)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標儀(德國BMG Labtech股份有限公司)；全景掃描儀(3D Histech Pannoramic MIDI，Hungary)；超聲細胞破碎儀(北京平利洋醫療設備有限公司)；高速低溫離心機(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備

1.3.2 金黃地鼠口腔頰囊宏觀分析

造模后觀察金黃地鼠右側口腔頰囊劃傷部分宏觀變化(紅斑、糜爛、血管擴張、上皮潰瘍和膿腫等)并拍照，進行評分。評分標準[6]如下：0分：頰囊健康，無糜爛、血管擴張等；1分：頰囊可見紅斑，無糜爛；2分：紅斑嚴重，血管擴張，有糜爛面；3分：黏膜可見一個或多個潰瘍面，總面積不超過頰囊表面區域面積的25%；4分：潰瘍面面積約為頰囊表面區域的50%；5分：頰囊黏膜幾乎完全潰爛。

1.3.3 口腔頰囊組織病理學檢測

取右側頰囊組織浸泡在4%多聚甲醛中進行常規石蠟包埋、切片(4 μm)及經蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后脫水封片，用全景掃描儀在20倍光鏡下拍照并觀察口腔黏膜病變情況。

1.3.4 血清中TNF-α和IL-1β含量測定

腹主動脈取血，靜置，2500 r/min離心10 min，分離血清。按照ELISA試劑盒的說明書測定血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.5 口腔頰囊組織生化指標檢測

將右側頰囊組織按照質量1∶9體積生理鹽水進行勻漿，離心并分離上清，按照SOD試劑盒、MDA試劑盒以及BCA蛋白定量試劑盒的使用說明進行測定。

(1)風化裂隙及采空塌陷導水裂隙。區內對煤礦床充水有明顯影響的風化裂隙主要發育在龍潭組及其上覆地層的地表淺部，而深部風化程度減弱，其導水性亦差。采礦期間產生的采空塌陷導水裂隙將起到主要的導水作用，其作用是溝通巷道上部水源，從而使充水水源滲入或涌入礦井。由此可見，采空塌陷導水裂隙具有明顯導水作用。

1.3.6 臟器指數測定

迅速剖取金黃地鼠胸腺和腎上腺，稱濕重，計算臟器指數：臟器指數=臟器質量(g)/體質量(g)× 100%。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠進食量和體重的影響

與對照組相比，模型組動物在造模后第1～8天內每只動物的日平均進食量顯著減少(P< 0.01)。模型組在造模后第8～14天內每只動物的日平均進食量有所恢復，與對照組相比無明顯差異(見表1)。

實驗期間，對照組動物的體重未見明顯變化，而造模后第8天模型組動物體重降低，其它時間點未見明顯變化(見表2)。

2.2 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠口腔頰囊宏觀變化的大體觀察

對照組頰囊比較紅潤且顏色較淺，無血管擴張，模型組在造模后第1天出現紅腫，與對照組相比頰囊顏色明顯較深，評分明顯升高，第3天出現潰瘍面但面積較小，評分達高峰(P< 0.01)，第8天之后顏色逐漸恢復，評分降低，且潰瘍情況明顯好轉，第10天及第14天的頰囊損傷恢復，評分與對照組相同(見圖1、表3)。

表1 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠進食量的影響Table 1 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on food intake of golden hamsters

注：與對照組相比，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

表2 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠體重的影響Table 2 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on the weight of golden hamsters

注：與對照組相比，P> 0.05。
Note. Compared with the control group,P> 0.05.

2.3 HE染色觀察5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠頰囊組織的病理損傷

頰囊組織HE染色結果顯示：對照組動物頰囊組織的表皮層結構清晰，真皮層膠原含量豐富且排列緊密；肌層部分肌細胞排列疏松，間隙增大，組織未見明顯炎癥反應。模型組動物在造模后第8天可見頰囊組織中皮下血管周圍有較多肥大細胞；第14天時，可見肌層肌細胞排列疏松，間隙增大且肌層血管附近有少量肥大細胞。與對照組相比，模型組炎癥反應重，肥大細胞數量多(見圖2)。

表3 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠口腔頰囊宏觀影響的評分Table 3 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on macroscopic scores of right cheek pouch of golden hamsters

注：與對照組相比，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：對照組；B：模型組造模后第1天；C：模型組造模后第3天；D：模型組造模后第8天；E：模型組造模后第10天；F：模型組造模后第14天。圖1 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠右側頰囊的宏觀影響Note. A: Control group. B: Model group on day 1 after surgery. C: Model group on day 3 after surgery. D: Model group on day 8 after surgery. E: Model group on day 10 after surgery. F: Model group on day 14 after surgery.Figure 1 Macroscopic effect of 5-FU combined with mechanical scratches on the right cheek pouch of golden hamsters

注：A：對照組第8天；B：模型組第8天；C：模型組第14天。肌層部分肌細胞間隙增大，如圖中紅色箭頭所示；皮下血管周圍較多肥大細胞，如圖中黑色箭頭所示。圖2 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠頰囊組織的影響(HE染色，× 20)Note. A: Control group on day 8. B: Model group on day 8. C: Model group on day 14. The space between some muscle bundles was increased, as indicated by the red arrow in the figure. High numbers of mast cells were present around subcutaneous blood vessels, as indicated by the black arrows in the figure.Figure 2 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on cheek pouch tissue in golden hamsters. HE staining

2.4 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響

與對照組相比，模型組在造模后第8天和第14天金黃地鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量均有明顯升高(P< 0.05，P< 0.01)。隨著時間的延長，模型組金黃地鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量逐漸升高(見表4)。

2.5 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠頰囊組織MDA含量和SOD活性的影響

與對照組相比，模型組在造模后第8天和第14天金黃地鼠頰囊組織中MDA的含量明顯升高(P< 0.05)，SOD的活性明顯降低(P< 0.05，P< 0.01)(見表5)。

2.6 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠臟器指數的影響

與對照組相比，模型組金黃地鼠第8天和第14天的腎上腺指數和胸腺指數均無明顯差異(見表6)。

表4 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響Table 4 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on serum TNF-α and IL-1β in golden hamsters

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表5 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠頰囊組織中MDA含量和SOD活性的影響Table 5 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on MDA content and SOD activity in cheek pouch tissue of golden hamsters

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表6 5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠的臟器指數的影響Table 6 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on the organ indexes of golden hamsters

注：與對照組相比，P> 0.05。
Note. Compared with the control group,P> 0.05.

3 討論

近年來，化療對腫瘤的治療作用越來越明顯，但是隨之而來的并發癥OM也越來越嚴重。據文獻報道[7]，對接受化療的患者進行口腔檢查時，發現59%的癌癥患者出現紅斑、糜爛等口腔軟組織炎癥。化療所致口腔黏膜損傷的發生機制可能與口腔黏膜上皮細胞的直接損傷作用和骨髓抑制等有關，但具體發病機制尚不完全明確[8]。有研究表明，OM的病理學過程分為五個階段：啟動，信息生成，信號放大，潰瘍和愈合。在初始階段，通過產生氧化應激和活性氧，內皮細胞、成纖維細胞和上皮細胞會出現DNA損傷。轉錄因子如核因子-κB(NF-κB)的激活導致許多基因上調，包括IL-1β和TNF-α，進而引發炎癥反應和增加皮下血管分布。這些細胞因子也參與正反饋循環，放大初始反應，最終可能導致疼痛的黏膜發生潰瘍[9]。

目前，國內有很多關于化療致OM的臨床研究報道，但是對于如何建立化療致口腔黏膜炎動物模型的研究卻很少。化療致OM產生的關鍵因素是化療藥物而非腫瘤自身，雖然選用正常動物在模擬臨床腫瘤患者化療后OM產生過程上有一定的局限性，但是相比荷瘤動物應用方便，也可出現類似于臨床的癥狀，故有關化療致OM的研究大多采用正常動物。國外用于OM研究的動物主要有：大鼠[10]，倉鼠[11]，金黃地鼠[6]等。倉鼠和金黃地鼠具有口腔頰囊大的典型特征，易于觀察，常被用作研究OM的動物模型。Lima等人[11]的研究證明了用5-FU干預倉鼠，然后對頰囊進行機械性創傷會導致嚴重的OM，在第5天出現紅斑，充血，出血以及大面積的潰瘍和膿腫，第10天炎癥程度達到最大。Medeiros等[12]使用5-FU誘導金黃地鼠口腔黏膜炎，在初次注射后第10天顯著增加了頰囊組織中TNF-α和IL-1β的含量。本實驗使用金黃地鼠研究5-FU聯合機械劃傷致OM的模型，通過拍照觀察發現在造模后第3天金黃地鼠口腔頰囊出現潰瘍面，炎癥反應最明顯且評分最高，隨著時間的延長，從第8天開始炎癥反應逐漸減輕，第14天基本恢復正常。HE染色顯示，在第8天和第14天模型組金黃地鼠頰囊組織均有肌細胞間隙增大及皮下血管周圍細胞肥大現象，存在炎癥反應。本研究還發現，在造模后第8天和第14天金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均明顯升高。這提示雖然宏觀方面觀察口腔頰囊在第8天后開始恢復，但是在第14天血清中促炎癥細胞因子的含量仍然較高，炎癥反應依然存在。本實驗結果可以看出，此造模方法模擬了化療藥物所致OM的臨床表現(如紅斑，潰瘍等)。

在OM的初始階段，口腔黏膜釋放自由基和各種炎癥介質誘導氧化應激，這種氧化應激狀態除了減少抗氧化酶如SOD的活性外，還會使MDA的水平增加[13]，而氧化應激損傷也會進一步加重炎癥反應。據文獻報道[14]，采用5-FU誘導雄性金黃地鼠口腔黏膜炎，頰囊組織中MDA的含量明顯較高，SOD的活性明顯較低。本研究發現，用5-FU聯合機械劃傷誘導金黃地鼠口腔黏膜炎，在造模后第8天及第14天頰囊組織中MDA的含量明顯升高，SOD的活力顯著下降。這提示5-FU聯合機械劃傷對金黃地鼠影響持續時間較長，在第14天MDA的含量和SOD的活性未見恢復，口腔頰囊組織炎癥反應仍然存在。

本研究還發現，與對照組比較，模型組金黃地鼠在造模后8 d內日平均進食量明顯減少且體重減輕，而第8～14天內的日平均進食量和體重未見明顯差異。這提示造模引起的口腔黏膜炎癥影響了動物進食和體重。

腎上腺和胸腺與體內的炎癥反應有關，胸腺是體內重要的免疫臟器，臟器相對質量的變化稱為臟器指數，能夠評估動物的免疫功能，同時也是臨床上最常用、最基本的評估指標[15]。本實驗中未見金黃地鼠的腎上腺指數和胸腺指數有明顯變化。

綜上所述，5-FU聯合機械劃傷可以引起OM的臨床癥狀，在造模后第3天最明顯，8 d后慢慢恢復，但促炎癥細胞因子和氧化應激反應在造模后14 d持續存在，提示成功建立金黃地鼠口腔黏膜炎動物模型，可用于口腔黏膜炎發病機制及治療藥物的研究。

注：金黃地鼠是倉鼠科倉鼠亞科金倉鼠屬動物，在公開出版物中使用倉鼠作為名稱更為科學。但鑒于目前我國實驗動物國家標準中提到的動物的種類都是地鼠，作為專業人員能夠清楚該物種在動物分類中地位，并不妨礙科學研究的成果和使用，故本文在發表時仍沿用“金黃地鼠”，待國標修訂后再統一命名為“倉鼠”。