阿司匹林對控制大鼠鹽敏感性高血壓的作用機制研究

劉 雪，楊宇輝，付 慧，劉 星，姜曉亮，楊志偉*

(1. 中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021；2. 北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，北京 100021；3. 首都醫科大學，北京 100069)

原發性高血壓是一種慢性復雜疾病，我國目前高血壓患者已有2億多人，其中鹽敏感性高血壓患者約占總患者的60%[1]，這些鹽敏感性患者往往伴有動脈粥樣硬化、腦卒中等嚴重的靶器官損傷[1-3]。有研究表明，高鹽能夠刺激血管內皮產生炎癥因子，進而誘發血管炎癥[4-5]。血小板活化能夠通過誘導炎癥反應參與內皮功能損傷、血管硬化和血管炎癥等血管病變，促進鹽敏感性高血壓以及多種心腦血管疾病的發生發展[6-10]。臨床研究發現，鹽敏感性高血壓患者體內血小板活性增強[11]。阿司匹林作為一種抗血小板藥物，近年來在心血管領域的應用越來越廣泛。2016年，美國已經將阿司匹林作為心血管疾病的一級預防用藥[12]，這再次引起了國內外對阿司匹林的關注。阿司匹林是否能抑制鹽敏性高血壓的發生發展，在國內外還沒見報道。本研究旨在探討阿司匹林是否能夠抑制高鹽誘導的高血壓的發生發展及其相關機制，為高血壓及其靶器官損傷的防治探索新的依據和參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性血壓鹽敏感性Dahl SS大鼠及其對照血壓鹽耐受性SS-13BN大鼠從北京維通利華實驗動物中心購買[SCXK (京) 2016-0006]。實驗在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所屏障環境動物房開展[SYXK (京) 2015-0035]。動物實驗方案獲實驗動物使用與管理委員會(IACUC)的批準[ILAS-YZW2016004]。實驗動物飼養于屏障環境中，光照、溫度、濕度設置嚴格參照我國實驗動物環境標準。實驗過程中嚴格遵循實驗動物使用的3R原則，給予人道主義關懷。將2月齡Dahl SS大鼠(平均體重190±10 g)以及SS-13BN大鼠(平均體重 185.1±9 g)，各自隨機分為三組，即低鹽組(0.12% NaCl，8只)、高鹽組(8% NaCl, 10只)、高鹽加阿司匹林灌胃組(8% NaCl+10 mg/(kg·d), 10只)，6組大鼠體重差異無顯著性(P>0.05)，喂養至8周，期間在清醒狀態下用尾袖法連續測量大鼠血壓。8周后采用頸總動脈插管測量血壓，2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取大鼠皮膚、腎、動脈血管，分別檢測M2型巨噬細胞的數量、相關炎癥因子和血管蛋白的表達。

1.2 主要試劑與儀器

阿司匹林(7293748372)和羧甲基纖維素(S14015-250 g)購自美國Sigma公司；Anti-Mannore Receptor (ab64693)、Anti-Von Willebrand Factor antibody (ab6994) 購自英國Abcom公司； eNOS(#32027)、IL-6單克隆抗體 (#12912) 購自美國Cell Signaling Technology公司；Goat anti rabbit IgG-HRP (sc-2004)、 TNF-α單克隆抗體 (sc-52746)、L-1β多克隆抗體購自美國Santa Cruz (sc-7884) 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(P0010)購自中國碧云天公司；Trizol 購自美國 Invitrogen 公司；DEPC 水購自美國 QIAGEN 公司；BP2000無創血壓檢測儀購自美國Visitech Systems公司；PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司；化學發光凝膠成像儀(Tanon-5500)購自上海天能公司；Multiskan Go全波長酶標儀購自美國Thermo公司； ABI stepone 熒光定量 PCR 儀購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Real-time PCR檢測腎組織炎癥因子表達

取少量腎組織(100～200 mg)放于5 mL EP管中，加入1 mL的TRIzol，放入攪拌器中充分研磨。加入200 μL 氯仿，用帶濾芯的槍頭移至干凈的1.5 mL EP管中混勻。冰上靜止5 min，4℃，16 000 r/min，離心30 min，取上清。加入500 μL異丙醇混勻后，室溫靜置10 min，11 235 r/min離心10 min棄上清。加入500 μL DEPC水稀釋的75%的乙醇，4℃，12 000 r/min，離心5 min，棄上清。超凈臺晾干，加入適量的DEPC水稀釋得RNA。使用RNA反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，并用One-stop PCR儀檢測其IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達。

1.3.2 免疫熒光檢測皮膚巨噬細胞浸潤

大鼠皮膚用福爾馬林固定后，修塊、脫水、包埋、切片(厚度為4 μm)，用Xylene、逐步降低的Ethanol濃度(分別100%、95%、75%)和PBS使組織切片脫蠟、再水化。皮膚組織用0.1% Triton X-100、10 mM sodium citrate (pH 6.0)、3% H2O2,處理，然后用含10% 血清的PBS在4℃過夜孵育。用MR(1∶100稀釋)在室溫孵育1 h后用Vector VIP substrate kit (Vector)試劑盒，逐步進行二抗孵育、DAPI封片后，最后顯微鏡下觀察、拍片。

1.3.3 免疫印跡檢測血管蛋白表達

提取大鼠胸主和腹主動脈血管全蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，流轉至硝酸纖維素膜，封閉液(0.1%緩血酸銨緩沖液配制5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h，加抗eNOS和vWF特異性抗體4℃孵育過夜，0.1%緩血酸銨緩沖液洗膜3次后加辣根過氧化物標記的IgG室溫孵育1 h，洗膜3次后，化學發光凝膠成像儀自動曝光顯影后使用Image J軟件分析灰度，結果以目的蛋白/β-actin灰度值比值表示蛋白質的相對表達水平。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 阿司匹林可顯著降低高鹽誘導的Dahl SS大鼠的血壓

大鼠動脈血壓連續測量結果顯示，實驗開始前三周，正常鹽組、高鹽組、高鹽同時給與阿司匹林灌胃組的Dahl大鼠血壓無明顯差異，從第四周開始，高鹽組大鼠血壓較正常鹽組大鼠血壓呈現大幅增長的現象，高鹽加阿司匹林灌胃組大鼠較高鹽組大鼠血壓有明顯較低的趨勢(表1)。八周之后采用頸總動脈插管測量血壓，結果顯示與正常組相比高鹽喂養導致Dahl SS大鼠平均動脈壓血壓由(146±7.3)mmHg升高至(201±11.2) mmHg(P<0.05)，給予阿司匹林灌胃之后發現大鼠血壓由(201±11.2)mmHg降低至(169±5.6)mmHg(P<0.05)。而高鹽和阿司匹林對SS-13BN大鼠的血壓并無影響(圖1，表2)。這表明阿司匹林能夠降低Dahl SS大鼠有由高鹽誘導的血壓增高。

2.2 阿司匹林減少了腎組織炎癥因子的表達

炎癥反應是高血壓發生發展的一個重要病理機制。因此，我們檢測了腎組織中的炎癥因子。結果顯示Dahl SS大鼠高鹽喂養之后，隨著血壓的升高，其腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達增加，阿司匹林能夠抑制Dahl SS大鼠腎組織高鹽誘導的炎癥因子的增加(見圖2)。

2.3 阿司匹林增加皮膚中M2型巨噬細胞的數量

為了進一步探討阿司匹林是否能抑制機體炎癥反應，我們檢測了Dahl SS大鼠皮膚中M2型巨噬細胞的表達數量，結果表明，給予高鹽處理之后Dahl大鼠皮膚中的M2型巨噬細胞數量較正常鹽組相比顯著減少，而給予阿司匹林灌胃干預之后，Dahl大鼠皮膚巨噬細胞的浸潤數量顯著增加，這表明阿司匹林能夠有效緩解高鹽誘導的M2型巨噬細胞數量的減少(見圖3)。

表1 鹽敏感性高血壓大鼠血壓情況Table 1 Blood pressure of Dahl salt sensitive rats

注：尾袖法連續八周檢測清醒狀態下鹽敏性高血壓大鼠動脈血壓，即收縮壓以及舒張壓。
Note. The arterial blood pressure including systolic pressure and diastolic pressure of Dahl salt-sensitive rats (DSS) was measured by the tail cuff method in an awake state.

表2 鹽耐受性高血壓大鼠血壓情況Table 2 Blood pressure of salt resistance rats

注：尾袖法連續八周檢測鹽耐受性大鼠清醒狀態下動脈血壓,包括收縮壓以及舒張壓.
Note. The arterial blood pressure including systolic pressure and diastolic pressure of Dahl salt-sensitive rats (13-BN) was measured by the tail cuff method in an awake state.

注：LS：低鹽飲食組，0.12% NaCl；HS：高鹽飲食組，8% NaCl；HS + ASA：高鹽飲食(8% NaCl)加阿司匹林灌胃組(10 mg/(kg·d))。下圖同。第56天采用頸總動脈插管測量大鼠動脈血壓。與LS組、HS + ASA組相比，*P< 0.05(one-way ANOVA)。圖1 阿司匹林對高鹽誘導的Dahl SS大鼠高血壓的影響Note: LS: low-salt diet, 0.12% NaCl; HS: high-salt diet, 8% NaCl; HS + ASA: high-salt diet (8% NaCl) plus aspirin gavage (10 mg/(kg·d)). The same in the following figures. Blood pressure was measured by the tail cuff method at day 56. Compared with LS group, HS + ASA group,*P< 0. 05 (one-way ANOVA).Figure 1 The effect of aspirin on blood pressure in Dahl SS rats with a high-salt diet

注： IL-1β：白介素-1β； IL-6：白介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α。第56天取材RT-PCR檢測炎癥因子。與LS組、HS + ASA組相比，*P< 0.05(one-way ANOVA)。圖2 阿司匹林對高鹽誘導的Dahl SS大鼠腎組織炎癥因子表達的影響Note. IL-1β: interleukin-1β; IL-6: interleukin-6; TNF-α: tumor necrosis factor-α. Inflammatory factors were measured at day 56 by RT-PCR. Compared with the LS group, HS + ASA group,*P< 0. 05 (one-way ANOVA).Figure 2 The effect of aspirin on the mRNA expressions of renal inflammatory factors in Dahl SS rats with a high-salt diet

注：MR：M2型巨噬細胞表面特定的標志分子甘露糖受體。圖3 阿司匹林對高鹽誘導的Dahl SS大鼠皮膚M2型巨噬細胞數量的影響(× 200)Note. MR: mannose receptor, a specific maker of M2 macrophages.Figure 3 The effect of aspirin on the number of M2 macrophages in the skin of Dahl SS rats with a high-salt diet

2.4 阿司匹林能夠改善血管內皮功能

為了探討阿司匹林是否能通過改善血管功能降低血壓，我們檢測了Dahl-SS大鼠血管內皮表達的血管舒張促進蛋白一氧化氮合酶(eNOS)和血管損傷標志物血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的表達。結果顯示，較低鹽組相比，高鹽喂養的Dahl大鼠血管一氧化氮合酶(eNOS)表達顯著降低，血管性血友病因子(vWF)表達顯著增高(P<0.05)，表明阿司匹林能夠抑制高鹽誘導的Dahl-SS大鼠血管內皮eNOS表達的降低(見圖4A)和vWF表達的增加(見圖4B)。

注：eNOS：內皮一氧化氮合酶；vWF：血管性血友病因子。與LS組、HS + ASA組比較，*P< 0.05(one-way ANOVA)。圖4 阿司匹林對高鹽誘導的Dahl SS大鼠血管內皮功能的影響Note. eNOS: endothelial nitric oxide synthase; vWF: von Willebrand factor. Compared with LS group, HS + ASA group,*P < 0.05 (one-way ANOVA).Figure 4 The effect of aspirin on vascular endothelium function in Dahl SS rats with a high-salt diet

3 討論

鹽敏感性高血壓是指相對高鹽攝入引起的血壓增高，其發病機理包括血管的收縮、機體的鈉水潴留、血管炎癥反應等[13]。巨噬細胞作為炎癥反應的主要作用細胞，在不同條件下，有著明顯的形態和功能差異。M1型巨噬細胞一般是通過干擾素-γ及細菌脂多糖LPS活化，M1主要分泌促炎因子；而M2型巨噬細胞通過Th2細胞因子進行活化，M2表達抑制炎癥因子，起著抑制炎癥反應以及組織修復的作用。高鹽引起高血壓的同時，也可誘導腦血管、心臟和腎等靶器官的損傷[8]。本研究發現，高鹽飲食誘導Dahl SS大鼠血壓升高的同時，增加了腎組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及血管vWF因子的表達，減少了皮膚M2型巨噬細胞數量及血管eNOS的表達；阿司匹林能夠明顯降低Dahl SS大鼠高鹽誘導的血壓升高、炎癥反應及血管功能的損傷。我們的研究表明阿司匹林能夠通過抑制血小板活性，抑制血管的炎癥反應，從而抑制高鹽誘導的高血壓的發生發展及其血管功能的損傷。

血小板是由骨髓造血組織中的巨核細胞產生的一種無核的細胞成分，越來越多的研究表明血小板在炎癥反應中起著重要的作用[14]，阿司匹林是最廣泛使用的抗血小板藥物，不可逆地抑制血小板內COX-1和COX-2的活性，阻斷花生四烯酸產生TXA2，抑制血小板的聚集[15]。臨床常用抗血小板藥物阿司匹林預防和治療冠狀動脈疾病和其他血管疾病，主要是由于阿司匹林可抑制血小板COX-1活性，降低血小板活化率，減少血清P-selectin、TXA2的表達及炎癥因子IL-6等的表達，降低炎癥反應，參與穩定性冠狀動脈疾病的治療[16-18]。阿司匹林能夠抑制氧化應激，降低原發性高血壓和血管緊張素II誘導的高血壓[19]。本研究發現，高鹽能夠刺激血管內皮并激活血小板從而引發血管炎癥反應，而阿司匹林可以抑制該過程的發生發展，表明阿司匹林在抑制血小板聚集的同時，也具有抑制血小板活性的功能。該結果證實阿司匹林通過抑制血小板活性，能夠緩解血管內皮炎癥反應和內皮損傷。

血管功能老化是導致高血壓的根本因素。本研究發現，高鹽能夠誘導活化的血小板與血管性血友病因子(VWF)結合并黏附到血管內皮細胞上[20]，這種相互作用會引起的內皮表面白細胞的黏附并分泌TNF-α等炎癥因子，促進炎癥反應的發生發展，使得血管內皮受到損傷，導致內皮eNOS分泌減少，最終導致血管老化及功能受損而導致高血壓。我們的研究發現，阿司匹林通過抑制高鹽誘導的血小板活性，抑制炎癥反應導致的血管功能損傷，從而抑制鹽敏感性高血壓的發生發展，為鹽敏感性高血壓的防治提供了新的防治思路。但是，高鹽如何導致血小板活化，以及血小板活化后如何通過炎癥反應導致高血壓的發生發展的具體機制還需要進一步研究。