參一膠囊聯(lián)合5-氟尿嘧啶對小鼠結腸癌血管生成抑制作用的機制研究

尤江蓮，郭 治，孫愛學

(河北省邢臺市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，河北 邢臺 054000)

結腸癌最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活習慣、食物譜發(fā)生了巨大變化，結腸癌的發(fā)生率也呈明顯的上升趨勢[1]。局部復發(fā)與轉(zhuǎn)移仍然是導致患者預后不佳的主要原因，血管生成是腫瘤組織保持高指數(shù)生長的營養(yǎng)前提，也是許多靶向藥物作用的靶點[2-3]。結腸癌的化療研究已達到了瓶頸期[4]，如何進一步提高化療療效，充分發(fā)掘祖國醫(yī)藥在結腸癌中的應用價值是一項嚴峻的課題。參一膠囊主要由人參皂苷Rg3成分組成，多項研究證實，其與傳統(tǒng)化療藥物配合，可增強對實體瘤的抑制作用[5-6]。但目前，關于參一膠囊在結腸癌中的研究報道極少。因此，本研究建立了BALB/c小鼠LoVo結腸癌模型，旨在探討參一膠囊對結腸癌生長及血管生成的抑制作用及可能的機制，以期為日后的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

50只SPF級BALB/c雄性小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量約23～27 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京) 2016-0001]。實驗在河北省人民醫(yī)院實驗動物中心進行[SYXK (冀) 2013-0056]，溫度21℃～25℃，自由飲食飲水，并按實驗動物使用的3R原則給與人道主義關懷。河北醫(yī)科大學動物倫理委員會批準同意，審查編號：20170816。

1.1.2 細胞株

LoVo(人結腸癌細胞株)購于上海細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑與儀器

VEGFA多克隆抗體、Gli1多克隆抗體購于美國Abcam公司。5-氟尿嘧啶注射液(5-FU)購于天津金耀氨基酸有限公司(批號0404281)，參一膠囊購于吉林亞泰制藥股份有限公司(批號：國藥準字Z20030044)。Western blot化學發(fā)光成像系統(tǒng)購于天能科技有限公司(Tanon4200SF)，微量移液器購于美國BD公司；-80℃超低溫冰箱(美國 Thermo 公司)；-20℃冰箱和4℃冰箱(中國海爾公司)。

1.3 結腸癌小鼠模型構建及分組

1.3.1 結腸癌小鼠模型的制備

采用細胞懸液接種液，收集對數(shù)生長期LoVo細胞，稀釋濃度為1×107個/mL，在小鼠前肢腋下皮下接種2×107個細胞。注射后按壓數(shù)秒，5天后建模成功者作為實驗小鼠。(2)分組標準：造模成功后，將50只小鼠隨機分為5組，根據(jù)處理方式的不同分別定義為為：①模型組：僅予以0.3 mL生理鹽水灌胃。②5-FU組：采用腹腔注射5-FU，劑量為30 mg/kg。③參一膠囊低劑量組：灌服參一膠囊2 g/kg。④參一膠囊高劑量組：灌服參一膠囊4 g/kg。⑤參一膠囊+5-FU組：腹腔注射5-FU(30 mg/kg)+灌服參一膠囊4 g/kg。以上治療措施均為每日一次，共用25 d。

1.3.2 觀察指標

(1)腫瘤體積：根據(jù)公式：V=0.5×腫瘤長徑×(與長徑垂直的短徑)2，根據(jù)測量結果繪制腫瘤體積變化的折線圖。(2)腫瘤微血管密度(MVD)：在第25天時處死小鼠，取腫瘤組織切片脫蠟，胰酶消化，PBS及H2O2沖洗，牛血清蛋白封閉，滴加CD34單抗，PBS沖洗后滴加羊抗兔IgG，蘇木素染色，脫水，二甲苯透明。在低倍鏡下選擇一個微血管最多的區(qū)域，再調(diào)整至200倍視野計算微血管均數(shù)。(3)結腸癌轉(zhuǎn)移情況：處死小鼠后，取淋巴結、腹膜、肝、肺等部位的組織標本，甲醛固定，HE染色，行病理學檢查。

1.3.3 Western blot檢測Gli1蛋白、VEGF蛋白表達

液氮研磨各組小鼠瘤組織，裂解，提取總蛋白，BCA發(fā)測定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL法顯影定影。通過Quantity One軟件分析條帶強度，以β-actin為內(nèi)參，檢測Gli1蛋白、VEGF蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同組小鼠腫瘤體積及抑瘤率比較

從干預開始，每5 d測量一次腫瘤體積，計算抑瘤率。與模型組相比，各治療組小鼠的腫瘤體積均受到明顯抑制。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+ 5-Fu組的抑瘤率最高，且隨著給藥時間的延長，這種抑制優(yōu)勢愈加明顯。見圖1。

2.2 不同組小鼠免疫器官情況比較

與模型組比較，5-FU組小鼠的免疫器官質(zhì)量及指數(shù)出現(xiàn)降低，其余治療組小鼠的免疫器官質(zhì)量及指數(shù)均有不同程度提高。5-FU組與參一膠囊低劑量組的各指標差異均無顯著性(P>0.05)，參一膠囊高劑量組的胸腺質(zhì)量、脾質(zhì)量明顯高于5-FU組及參一膠囊低劑量組，參一膠囊+ 5-FU組的胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾質(zhì)量、脾指數(shù)改善最為顯著，明顯好于所有其他治療組(P<0.05)。見表1。

注：A：模型組；B：5-FU組；C：參一膠囊低劑量組；D：參一膠囊高劑量組；E：參一膠囊+ 5-FU組。圖1 不同組小鼠腫瘤體積變化曲線Note: A: Model group; B: 5-FU group; C: Shenyi capsule low dose group; D: Shenyi capsule high dose group; E: Shenyi capsule + 5-FU group.Figure 1 Changes of tumor volume of mice in different groups

2.3 不同組小鼠MVD比較

模型組、5-FU組、參一膠囊低劑量組、參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組小鼠腫瘤的MVD分別為(13.67±4.61)、(11.67±4.12)、(5.34±2.24)、(2.32±1.57)、(0.67±0.51)，兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，參一膠囊+5-FU組對MVD的抑制作用最明顯，參一膠囊高劑量組次之，低劑量組抑制更弱，單純5-FU組對腫瘤MVD無明顯影響。見圖2。

表1 不同組小鼠免疫器官情況比較Table 1 Comparison of immune organs of mice in different groups

注：與模型組相比，aP< 0.05；與5-FU組相比，bP< 0.05；與參一膠囊低劑量組相比，cP< 0.05；與參一膠囊高劑量組相比，dP< 0.05。
Note. Compared with the model group,aP< 0.05. Compared with the 5-FU group,bP< 0.05. Compared with the Shenyi capsule low dose group,cP< 0.05. Compared with the Shenyi capsule high dose group,dP< 0.05.

2.4 不同組小鼠結腸癌轉(zhuǎn)移情況比較

模型組小鼠的局部淋巴結轉(zhuǎn)移率、肝轉(zhuǎn)移率、肺轉(zhuǎn)移率、腹膜轉(zhuǎn)移率分別為100%(10/10)、80%(8/10)、70%(7/10)、90%(9/10)。與模型組相比，5-FU組、參一膠囊低劑量組小鼠各種類型的結腸癌轉(zhuǎn)移均未表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P>0.05)。高劑量參一膠囊組、參一膠囊+5-FU組小鼠的結腸癌各器官轉(zhuǎn)移率均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.5 不同組小鼠腫瘤組織Gli1蛋白、VEGF蛋白表達量比較

Western blot檢測結果顯示，與模型組相比，5-FU組及參一膠囊低劑量組小鼠的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達量均較低，但差異無顯著性(P>0.05)。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達量則顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)。見表3。

注：兩組之間比較，※P< 0.05。圖2 不同組小鼠MVD比較Note. Comparisons between the two groups,※P < 0.05.Figure 2 Comparison of MVD of mice in different groups

表2 不同組小鼠結腸癌轉(zhuǎn)移情況比較Table 2 Comparison of colon cancer metastasis in mice of different groups

注：與模型組相比，aP< 0.05；與5-FU組相比，bP< 0.05。
Note. Compared with the model group,aP< 0.05. Compared with the 5-FU group,bP< 0.05.

表3 不同組小鼠腫瘤組織Gli1蛋白、VEGF蛋白表達量比較Table 3 Comparison of Gli1 and VEGF protein expressions in tumor tissues of mice in different groups

注：與模型組相比，aP<0.05；與5-FU組相比，bP<0.05
Note. Compared with the model group,aP< 0.05. Compared with the 5-FU group,bP< 0.05.

3 討論

傳統(tǒng)中藥人參具有大補元氣、補脾益肺、安神益智的功效，人參皂苷是其主要成分。參一膠囊是從人參中提取的有效單體，代號為Rg3，是傳統(tǒng)中藥人參中一種微量的四環(huán)三萜皂苷。有研究表明，其與化療合并用藥，對小鼠肝癌模型有顯著的增強化療療效作用，并可調(diào)節(jié)免疫功能，預防白細胞下降。在人體中，主要作用表現(xiàn)為，培元固本，補益氣血，改善腫瘤患者的氣虛癥狀，提高機體免疫功能。以往的研究表明，人參皂苷Rg3可通過作用于細胞增殖周期G2/M期，抑制腫瘤生長，甚至誘導腫瘤細胞凋亡，同時，具有抑制新生血管形成以及調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用。參一膠囊多種實體腫瘤的生長具有抑制作用，是化療增效劑，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等[7-8]。尤其是對于晚期非小細胞肺癌，參一膠囊可通過抑制腫瘤血管生成，提高患者免疫功能，起到顯著的化療增效減毒效應[9-10]。但在結腸癌中，相關的研究報道很少。

以VEGF為靶點的多種抗腫瘤藥物已被應用于臨床，但在臨床實踐中，普遍未獲得與動物實驗相似的理想效果，有效率最低僅在30%左右[11]。同時，對多線治療失敗的轉(zhuǎn)移性、復發(fā)性結腸癌，持續(xù)應用VEGF抑制劑的有效性仍需要更多的循證醫(yī)學證據(jù)。本研究在建立BALB/c小鼠LoVo結腸癌模型的基礎上，對5組小鼠采取不同的處理方式，包括生理鹽水灌胃、腹腔注射5-FU、灌服參一膠囊2 g/kg、灌服參一膠囊4 g/kg以及腹腔注射5-FU(30 mg/kg)+灌服參一膠囊4 g/kg，結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，各治療組小鼠的腫瘤體積均受到明顯抑制。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-Fu組的抑瘤率最高，且隨著給藥時間的延長，這種抑制優(yōu)勢愈加明顯。這表明，參一膠囊聯(lián)合5-Fu可產(chǎn)生更明顯的協(xié)同作用。胸腺與脾是小鼠最重要的免疫器官，其中，胸腺與細胞免疫相關，與自身免疫耐受及自穩(wěn)功能維持密切相關。脾是外周淋巴器官，是免疫活性細胞分化成熟的場所，也是免疫應答的場所。二者對細胞毒性物質(zhì)十分敏感，在化療藥物的作用下可迅速發(fā)生結構損傷及功能障礙，因此，胸腺與脾的質(zhì)量在一定程度上可作為評價藥物對免疫系統(tǒng)功能影響的指標[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各治療組小鼠的免疫器官質(zhì)量及指數(shù)均有不同程度提高，但5-FU組與參一膠囊低劑量組的各指標改善情況均無明顯差異，而參一膠囊+5-FU組的胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾質(zhì)量、脾指數(shù)改善顯著，明顯好于所有其他治療組，這反應了參一膠囊對免疫系統(tǒng)的保護作用。

Hedgehog信號通路由1個配體、2個跨膜蛋白、3個下游轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)構成，整個信號通路最終通過Gli控制靶基因的表達而產(chǎn)生作用[13; 14]。在本研究中，我們通過敏感度較高的Western-blot法檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，5-FU組及參一膠囊低劑量組小鼠的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達量均較低，但差異無顯著性(P>0.05)。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達量則顯著降低，差異有顯著性。這表明，Hedgeog-Glin1信號通路相關的VEGF表達可能是參一膠囊作用的靶點之一。Smo蛋白是Hedgehog信號通路的跨膜蛋白之一，Yzmazaki等[15]發(fā)現(xiàn)，與Smo-的結腸癌組織相比，Smo+結腸癌組織的微血管密度明顯更高，這提示Hedgeog-Glin1信號通路可能參與了腫瘤微血管的生成。在本研究中，模型組、5-FU組、參一膠囊低劑量組、參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組小鼠腫瘤的MVD分別為(13.67±4.61)、(11.67±4.12)、(5.34±2.24)、(2.32±1.57)、(0.67±0.51)，參一膠囊+5-FU組對MVD的抑制作用最明顯，參一膠囊高劑量組次之，低劑量組抑制更弱，單純5-FU組對腫瘤MVD無明顯影響。同時，參一膠囊+5-FU組的VEGF蛋白表達量也顯著降低。這表明，集解毒、扶正、活血等功效于一方的參一膠囊對結腸癌動物模型有良好的治療效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，參一膠囊對結腸癌腫細胞長及血管生成均有明顯的抑制作用，這種抑制作用在于5-FU配伍應用時更為顯著，Hedgeog-Glin1信號通路相關的VEGF表達可能是其主要的作用靶點。