中縫背核5-HT神經(jīng)元在丙泊酚麻醉-覺醒過(guò)程中的作用

張鴻磊，李敬，張林勇，鄢貞琦

(遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州遵義563000)

全身麻醉藥物應(yīng)用臨床已逾百年，但是其具體作用機(jī)制現(xiàn)在仍不明。研究顯示，全身麻醉意識(shí)消失和恢復(fù)時(shí)產(chǎn)生的腦電變化與大腦睡眠狀態(tài)及覺醒狀態(tài)的腦電改變類似[1]。Brown等[2～5]研究中，功能核磁共振顯示,在丙泊酚麻醉狀態(tài)和睡眠狀態(tài)下，下丘腦和丘腦區(qū)域的抑制輸出均增強(qiáng);且腦電圖也均以慢波節(jié)律為主，提示丙泊酚麻醉和睡眠-覺醒過(guò)程可能存在共同的神經(jīng)環(huán)路。有研究認(rèn)為,睡眠-覺醒相關(guān)通路可能參與全身麻醉藥物的麻醉作用[3]。中縫背核是腦內(nèi)合成和釋放5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)元聚集的重要區(qū)域，廣泛投射至端腦、中腦和間腦[6]，參與調(diào)控多種生理功能如睡眠-覺醒[7]、獎(jiǎng)賞行為[8]、覓食行為[9]、疼痛的耐受性[10]以及情緒相關(guān)行為等。近年大量研究[11，12]提示，中縫背核內(nèi)5-HT神經(jīng)元及其投射區(qū)域是腦內(nèi)的重要覺醒通路，中縫背核的5-HT神經(jīng)元在覺醒期間釋放的5-HT增加，且其神經(jīng)元的電活動(dòng)也明顯增強(qiáng)。丙泊酚為臨床常用麻醉藥物，其主要作用于γ氨基丁酸(GABAA)受體，使細(xì)胞內(nèi)CL-內(nèi)流產(chǎn)生抑制神經(jīng)元活動(dòng)，而中縫背核的5-HT也廣泛分布GABAA受體。以上研究結(jié)果提示,中縫背核的5-HT神經(jīng)元可能參與丙泊酚麻醉-覺醒過(guò)程。為進(jìn)一步探討中縫背核的5-HT神經(jīng)元在全身麻醉過(guò)程中的作用,2017年8月～2018年4月，本研究觀察了激動(dòng)或抑制中縫背核的5-HT神經(jīng)元后，丙泊酚麻醉大鼠蘇醒時(shí)間及腦電波的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 健康SPF級(jí)成年雄性SD大鼠30只，300～350 g,購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005。1%丙泊酚(阿斯利康公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030427)、GABAA受體激動(dòng)劑(蠅蕈醇，Sigma公司，美國(guó))、GABAA受體抑制劑(荷苞牡丹堿，Sigma公司，美國(guó))。大鼠腦立體定位儀(STOELTING公司，美國(guó))、動(dòng)物保溫系(STOELTING公司，美國(guó))、顱骨鉆(STOELTING公司，美國(guó))、手術(shù)顯微鏡(WPI公司，美國(guó))、鎢絲電極(Tungsten Microelectrode，300K-500K：美國(guó))、微量注射泵(史密斯公司，中國(guó))。

1.2 中縫背核微注射模型的建立及分組 按40 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，大鼠固定于腦立體定位儀，切開頭皮暴露顱骨，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜定位中縫背核：前后：+7.8 mm，深度：6.5 mm，并行顱骨鉆孔術(shù)，暴露硬腦膜并輕輕撥開，將套管針放置到中縫背核內(nèi)；在前額葉運(yùn)動(dòng)皮層即M區(qū)(前后：+2.0 mm，ML:+1.8 mm,DV：-2.0 mm)左右分別置入2個(gè)腦電記錄電極，待術(shù)后大鼠恢復(fù)1周后進(jìn)行組織學(xué)定位，套管位置位于中縫背核即為模型制作成功。將微注射模型隨機(jī)分為激動(dòng)劑組、拮抗劑組、對(duì)照組，各10只。

1.3 丙泊酚麻醉及GABAA受體激動(dòng)劑、抑制劑給予方法 將各組大鼠置于固定鼠籠中暴露尾靜脈，24 G動(dòng)物靜脈留置針置入大鼠尾靜脈，固定尾靜脈套管后，待大鼠恢復(fù)30 min后丙泊酚麻醉，以11 mg/kg誘導(dǎo)劑量推注丙泊酚，記錄大鼠從開始麻醉給藥到覺醒的時(shí)間。大鼠麻醉后即翻正反射消失后，輕柔置入微注射套管內(nèi)芯，激動(dòng)劑組、拮抗劑組、對(duì)照組分別給予GABAA受體激動(dòng)劑(蠅蕈醇 0.5 nmol/μL)、GABAA受體抑制劑(荷苞牡丹堿0.5 nmol/μL)、生理鹽水各1 μL，待大鼠蘇醒，記錄麻醉蘇醒時(shí)間。

1.4 腦電活動(dòng)觀察 經(jīng)尾靜脈推注丙泊酚(11 mg/kg)快速誘導(dǎo)，使大鼠意識(shí)消失，取下微注射導(dǎo)管帽，拔出導(dǎo)管芯，連接好注射內(nèi)管和微量注射泵，尾靜脈連接延長(zhǎng)管連續(xù)泵注丙泊酚(60 mg/kg·h)維持30 min，用腦電圖連續(xù)記錄M區(qū)皮層腦電活動(dòng)。在麻醉維持30 min，三組大鼠中縫背核腦區(qū)微注射GABAA受體激動(dòng)劑、GABAA受體抑制劑和生理鹽水各1 μL。麻醉繼續(xù)維持10 min停止微注射，用腦電圖記錄微注射給藥后10 min腦電活動(dòng)，取出微注射管芯和延長(zhǎng)管。

2 結(jié)果

2.1 三組麻醉蘇醒時(shí)間比較 對(duì)照組、激動(dòng)劑組及抑制劑組麻醉蘇醒時(shí)間分別為(844.11±75.66)、(1 167.74±93.95)、(636.44±66.17)s。與對(duì)照組相比，激動(dòng)劑組大鼠麻醉蘇醒時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，抑制劑組麻醉蘇醒時(shí)間縮短(P<0.05)。

2.2 三組腦電波變化情況 丙泊酚麻醉時(shí)，激動(dòng)劑組微注射GABAA受體激動(dòng)劑前δ波(1～4 Hz)比率為0.292 6±0.142 7、β波(12～25 Hz)比率為0.280 4±0.104 6，注射GABAA受體激動(dòng)劑后δ波比率為0.459 6±0.223 0、β波比率為0.189 7±0.086 6。與微注射前比較，激動(dòng)劑組微注射后腦電圖δ波比率增高(P<0.05)、β波比率降低(P<0.05)。丙泊酚麻醉時(shí)，拮抗劑組微注射GABAA受體拮抗劑前δ波比率為0.407 0±0.072 8、β波比率為0.215 2±0.033 1，注射GABAA受體拮抗劑后δ波比率為0.210 4±0.096 9、β波比率為0.350 2±0.079 7。與微注射前比較，微注射后拮抗劑組δ波比率降低(P<0.05)、β波比率增高(P<0.05)。丙泊酚麻醉時(shí)，激動(dòng)劑組微注射生理鹽水前δ波比率為0.312 5±0.132 7、β波比率為0.234 6±0.153 2，注射生理鹽水后δ波比率為0.341 2±0.146 8、β波比率為0.245 9±0.124 5。與微注射前比較，對(duì)照微注射后腦電圖δ波比率和β波比率比較，P均>0.05。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)調(diào)控學(xué)說(shuō)認(rèn)為，丙泊酚產(chǎn)生的全麻效應(yīng)可能與作用于睡眠-覺醒神經(jīng)環(huán)路有關(guān)。Purdon等[5]研究認(rèn)為，丙泊酚麻醉誘導(dǎo)意識(shí)消失的特征性腦電圖為睡眠梭形波，而睡眠梭形波也是非快動(dòng)眼睡眠期(NREMS)的特征腦電。近年研究均提示網(wǎng)狀上行激動(dòng)系統(tǒng)參與全身麻醉過(guò)程[13～15]。網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)是維持機(jī)體覺醒的重要通路，而中縫背核是其中的重要核團(tuán)，越來(lái)越多的研究表明中縫背核分泌的5-HT在覺醒過(guò)程起著一定的作用。研究[15]發(fā)現(xiàn)，中縫背核的5-HT神經(jīng)元在覺醒期穩(wěn)定放電，在慢波睡眠期(SWS)和NREMS放電明顯減少，而在快動(dòng)眼睡眠期(REMS)電活動(dòng)則完全受到抑制。Mukaida等[16]發(fā)現(xiàn)，異氟醚可以減少皮層及海馬中的5-HT水平，而被氟西丁抑制5-HT攝取的大鼠則需增加異氟醚的麻醉濃度,上述研究均提示中縫背核的5-HT神經(jīng)元可能參與調(diào)控麻醉的覺醒過(guò)程。

Cui等[17]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在中縫背核腦區(qū)微注射神經(jīng)元興奮劑Ca2+，5-HT釋放增加，5-HT神經(jīng)元的c-fos表達(dá)量(反映神經(jīng)元活動(dòng))明顯增加，大鼠覺醒時(shí)間增加，而SWS和REMS時(shí)間均減少；同時(shí)經(jīng)典促覺醒核團(tuán)藍(lán)斑核(LC)和穹窿周圍區(qū)的c-fos表達(dá)量也增加，促睡眠核團(tuán)腹外側(cè)視前核(VLPO)的c-fos表達(dá)量則減少。Monti等[6]研究認(rèn)為，GABA可調(diào)控中縫背核突觸前膜的興奮性，在中縫背核微注射GABAA受體激動(dòng)劑可以增加REMS睡眠時(shí)間，給予5-HT受體抑制劑則明顯減少REMS睡眠時(shí)間。本研究結(jié)果提示抑制中縫背核5-HT神經(jīng)元活動(dòng)可延遲丙泊酚麻醉大鼠蘇醒，而激活中縫背核的5-HT神經(jīng)元可加速丙泊酚麻醉大鼠的覺醒，說(shuō)明中縫背核5-HT神經(jīng)元可促進(jìn)丙泊酚麻醉大鼠的蘇醒。

腦電圖能較客觀地反映皮層神經(jīng)元的興奮性，一般認(rèn)為睡眠期間是以低頻(<8 Hz)波(δ波、θ波)為主，在清醒期間則是以高頻β波為主。在異氟醚麻醉下，Pillay等[13]電刺激促覺醒核團(tuán)腦橋網(wǎng)狀核，發(fā)現(xiàn)皮層的興奮性增加，且δ波和θ波的比率顯著降低。在丙酚麻醉中，中央內(nèi)側(cè)丘腦微注射去甲腎上腺素可縮短麻醉蘇醒時(shí)間，同時(shí)皮層的θ波比率也降低[18]。利用光遺傳技術(shù)發(fā)現(xiàn)，激活中縫背核的多巴胺神經(jīng)元可以促進(jìn)受試動(dòng)物覺醒并且δ波明顯減少，而用藥物遺傳學(xué)選擇性抑制中縫背核的多巴胺神經(jīng)元?jiǎng)t受試動(dòng)物覺醒時(shí)間縮短[7]。在中縫背核微注射Ca2+螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸可以明顯增加戊巴比妥麻醉期間的慢波頻率[19]。本研究中，大鼠M區(qū)皮層腦電圖結(jié)果顯示，微注射GABAA受體抑制劑激活中縫背核后δ波比率降低,β波比率增高，皮層興奮性增高，腦電波呈覺醒趨勢(shì)改變，麻醉大鼠蘇醒時(shí)間縮短；微注射GABAA受體激動(dòng)劑抑制中縫背核的5-HT，δ波比率增高、β波比率降低，腦電波呈睡眠的趨勢(shì)改變，麻醉大鼠蘇醒時(shí)間延長(zhǎng)。提示中縫背核的5-HT神經(jīng)元參與丙泊酚麻醉的蘇醒過(guò)程中。

綜上所述，網(wǎng)狀上行系統(tǒng)中縫背核的5-HT神經(jīng)元在丙泊酚麻醉-覺醒過(guò)程中發(fā)揮著促覺醒作用，但由于麻醉及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，明確中縫背核的5-HT神經(jīng)元具體作用機(jī)制及其調(diào)控的通路還有待深入探討。