接受常規體外受精、卵胞漿內單精子注射者囊胚培養及妊娠結局對比觀察

劉文婷,楊菁

(武漢大學人民醫院生殖中心,武漢430060)

體外受精是指在體外環境中將成熟卵子和精子在人工控制環境下相互作用并結合成受精卵的過程。根據精子和卵子孵育時間以及精子進入卵子內部方式可將體外受精分為常規體外受精、短時體外受精、ICSI授精以及補救ICSI授精等。目前最常見體外受精方式為常規體外受精(IVF)和卵胞漿內單精子注射(ICSI)。國內已有學者對兩種受精方式的囊胚形成率及妊娠結局進行了比較，認為在同樣的選擇性囊胚培養納入標準下,相比于ICSI,接受IVF者囊胚形成率和胚胎利用率更高[1],但由于沒有考慮到IVF與ICSI兩種受精方式在精液參數上存在明顯差異，無法排除因精液參數的差異而導致不同受精方式囊胚培養結局的差異。本研究中，我們除了根據受精方式不同進行分組以外，并根據精液參數的不同將ICSI進一步分為正常精液與少弱精子精液亞組，比較不同受精方式的囊胚培養結局及凍融囊胚移植妊娠結局，以探討不同受精方式對囊胚培養結局及妊娠結局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2017年12月在湖北省婦幼保健院生殖中心接受常規體外受精(IVF)/卵胞漿內單精子注射(ICSI)的女性受者1 230例。納入標準:女方年齡≤35歲；可獲取新鮮的卵子和精液者；囊胚培養第3天(D3)可利用胚胎數≥6(可利用胚胎為卵裂球數目≥4,且碎片≤25%)且未行胚胎冷凍；凍融周期囊胚移植者。排除標準:卵巢功能異常者；精液來源于附睪穿刺取精和睪丸穿刺取精者；行新鮮周期囊胚移植者。按受精方式不同分為IVF組994例、ICSI組236例，ICSI組按照精液參數的不同分為ICSI正常精液組90例、ICSI少弱精組146例。IVF組平均年齡29.27歲、平均不孕年限2.92年、平均獲卵數20.24個、平均囊胚移植數1.86個、平均治療周期數1.13個、平均BMI 25.56 kg/m2、平均基礎卵泡刺激激素(FSH)6.12 IU/L，ICSI少弱精組組平均年齡29.11歲、平均不孕年限3.04年、平均獲卵數21.89個、平均囊胚移植數1.83.個、平均治療周期數1.16個、平均BMI 1.93 g/m2、平均FSH 5.88 IU/L，ICSI正常精液組平均年齡30.38歲、平均不孕年限3.02年、平均獲卵數18.22個、平均囊胚移植數1.81個、平均治療周期數1.24個、平均BMI 22.14 kg/m2、平均FSH 6.14 IU/L。三組年齡、獲卵數、囊胚移植數、治療周期數、不孕年限、BMI以及基礎FSH比較無統計學意義(P均>0.05)。

1.2 卵子、精子的提取及體外受精 卵子的提取:當患者一半以上卵泡直徑≥14 mm時，于當晚注射重組HCG，36 h后陰道超聲引導下 取卵。精子的提取:入選患者均禁欲3～7 d,收集手淫當日新鮮精液；IVF患者采用密度梯度離心法洗滌，后通過上游法收集上層精子，在授精皿中調至合適濃度待授精。ICSI組的顯微注射均由高年資經驗豐富的工作人員操作，排除因人員技術對胚胎發育的影響。ICSI少弱精患者因精子參數差為保證獲得足夠的精子，采用微量梯度離心法或直接離心法。ICSI正常精液組采用密度梯度離心法洗滌后，利用精子自身運動上游將活動的精子從精液中分離出來。授精:IVF組在HCG注射后39～40 h內完成授精，ICSI少弱精組和ICSI正常精液組取卵后3～4 h用80 IU/mL的透明質酸酶去除卵丘顆粒細胞，將排出第一極體的成熟卵子行ICSI。授精16～18 h，在光學顯微鏡下觀察受精情況，出現雙原核視為正常受精。根據Peter卵裂期胚胎評分標準評估D3胚胎質量,優胚為D1出現雙原核，D2卵裂球數目2～5個，D3卵裂球數目≥6個且碎片≤10%。

1.3 囊胚培養及移植 將符合囊胚培養患者(年齡≤35歲；D3可利用胚胎數≥6)的胚胎采用序貫培養基(SAGE)進行囊胚培養至第5～6天，按Gardner囊胚分級系統對囊胚進行分級，然后冷凍囊胚。根據囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚的發育分為6個時期:1期:早期有腔室囊胚，囊胚腔體積小于胚胎總體積的1/2；2期:囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期:擴張囊胚，囊胚腔完全占據了胚胎的總體積；4期:囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期:正在孵出，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期:孵出囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚，還需對其內細胞團和滋養層細胞進行分級。內細胞團分級:A級:細胞數目多，排列緊密；B級:細胞數目少，排列松散；C級：細胞數目很少。滋養層分級:A級:上皮細胞層有較多的細胞組成，結構致密；B級:上皮細胞層由不多的細胞組成，結構松散；C級:上皮細胞層由稀疏的細胞組成，大細胞很少。將D5或D6評分3AA、3BA、3AB、4AA、4BA、4AB的囊胚定義為優質囊胚。囊胚移植:采用玻璃化試劑(KITAZATO)解凍囊胚，凍融囊胚復蘇后在囊胚培養液中培養至少2 h，能重新擴張成正常內細胞團和正常外滋養層形態的囊胚視為存活。將待移植囊胚移入移植皿，用培養液潤洗移植內管，鏡下不超過20 μL培養液裝胚胎。由實驗室工作人員將移植管移交給臨床醫生，在腹部B超引導下進行胚胎移植。對于移植囊胚后妊娠者給予黃體酮支持10～12周。

1.4 胚胎質量、囊胚培養及臨床妊娠結局的觀察 ①胚胎質量參數(包括正常受精率、卵裂率、優胚率):IVF正常受精率=(D1出現2PN及2PB卵子數)/IVF加精卵子總數×100%;ICSI正常受精率=(D1出現2PN及2PB卵子數)/注射MⅡ卵子總數×100%;卵裂率=D2卵裂胚胎數/正常受精卵子數；優胚率=優胚數/2PN卵裂數×100%。②囊胚培養結局(囊胚形成率、胚胎種植率):囊胚形成率=(D5/6總囊胚數)/正常受精卵子數×100%；胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%。③臨床妊娠結局:臨床妊娠率=妊娠周期數/移植周期數×100%。妊娠結局判定:囊胚移植14 d檢測尿、血HCG陽性為生化妊娠，囊胚移植28 d B超見孕囊為臨床妊娠。

2 結果

共納入1 230個取卵周期，IVF組994個，ICSI組236個,其中ICSI正常精液組90個、ICSI少弱精組146個。

2.1 三組胚胎質量參數比較 三組正常受精率、卵裂率、優胚率比較，P均>0.05,見表1。排除D3養囊胚前因胚胎質量差異導致的囊胚形成率的差異。

表1 三組胚胎質量參數

2.2 三組囊胚培養結局及臨床妊娠結局比較 IVF組囊胚形成率高于ICSI少弱精組和ICSI正常精液組(P均<0.01)；ICSI少弱精組和ICSI正常精液組囊胚形成率比較，P>0.05。三組胚胎種植率、臨床妊娠率比較,P均>0.05,見表2。

表2 三組囊胚形成率、胚胎種植率及臨床妊娠率

3 討論

相比于ICSI，IVF的受精方式更接近自然受精過程，精子和卵子通過自然篩選和選擇結合在一起，能與卵子自然結合的精子在DNA的完整性上優于不能與卵子結合的精子[2]。ICSI讓男性不育癥，特別少弱畸精癥的患者或常規IVF不受精，或受精率很低的患者得到有效治療，但是這種受精方式失去了自然選擇過程。有研究[3]發現，ICSI授精顯微鏡下人為選擇活力和形態學正常的精子在染色體和DNA碎片上也可能存在一定異常。也有研究[4]表明，精子DNA碎片與IVF/ICSI早期胚胎發育顯著相關，精子DNA碎片越高、IVF/ICSI結局也越差。精子本身的缺陷有可能導致卵裂期胚胎在4-8細胞發育階段以及囊胚發育階段發育緩滯[5]。本研究中ICSI少弱畸精組和ICSI正常精液組優胚率、囊胚形成率、臨床妊娠率及胚胎種植率差異均無統計學意義，提示在我們在現有的技術條件下行ICSI，通過顯微鏡挑選形態學正常的精子，可降低精液參數差異導致的胚胎發育障礙風險，但本研究也有自身的局限性，在納入標準中能達到囊胚培養標準的患者，并未包含極端形態異常致無法挑選出正常形態精子的特殊患者。

囊胚培養是在適宜的培養條件下，延長體外胚胎培養至第5～6天的囊胚階段。囊胚培養能篩選更有潛力的胚胎,且囊胚期移植與子宮內膜發育更同步、有更低的異位妊娠率、更好的抗凍能力以及有利于胚胎植入前遺傳學診斷等諸多優勢。已有研究[6～9]表明，囊胚培養可篩選出發育潛能較好的胚胎，且囊胚期移植更接近生殖內膜環境，顯著提高了胚胎種植率。囊胚期移植的優勢也很明顯，選擇高質量的囊胚進行移植可顯著提高胚胎種植率及臨床妊娠率。囊胚培養也有不足之處，要求條件高，有可能因為實驗室培養條件或胚胎自身原因，胚胎停止發育或退化，導致沒有胚胎可移植。由于體外培養環境終究不是體內自然環境，延長培養時間也可能使一部分能夠著床的卵裂期胚胎退化。目前大多數生殖中心根據受者年齡、治療周期數、受精數、獲卵數和D3優胚數等指標以及自身意愿綜合考慮是否進行囊胚培養，以提高囊胚形成率，但受精方式對于囊胚培養結局是否有影響還未有定論。汪彩珠等[1]研究報道，選擇IVF授精方式的受者比選擇ICSI授精方式的受者有更高的囊胚形成率。本研究結果顯示，IVF組、ICSI正常精液組2PN受精率、卵裂率、優胚率、臨床妊娠率及胚胎種植率均無統計學差異，但囊胚形成率卻有統計學差異。提示，接受不同受精方式的受者囊胚形成率有差異，這個差異可能與體外不同受精方式的操作過程有關，具體原因考慮如下:ICSI操作會增加選擇DNA受損精子和侵入外源性物質(PVP或者培養液)及垂直傳遞親代遺傳缺陷的風險[10～12]；ICSI在操作過程中對卵母細胞的微管、微絲系統和紡錘體可能產生機械損傷[13,14]；ICSI受精會增加超微結構異常及內部DNA微缺失的精子注入卵母細胞的風險，雖然這項操作并不影響卵子受精，但可能導致胚胎發育緩滯影響囊胚形成[15～17]；當精子DNA碎片率小于8%時，卵子可自行修復，但超過這個范圍將會影響胚胎的發育潛能[18]。

總之，接受不同授精方式的受者囊胚形成率有差異，妊娠結局類似。至于授精方式對于囊胚培養結局及妊娠結局是否有影響，需要進一步進行多因素回歸分析及更多的臨床研究證實。